살모넬라 검출을 위한 고리매개등온증폭법 기반 측방유동스트립
Lateral flow strip based on loop-mediated isothermal amplification for detection of Salmonella
특허 요약
본 발명은 살모넬라 검출을 위한 고리매개등온증폭법 기반 측방유동스트립에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고리매개등온증폭(loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트; 상기 프라이머 세트에 의해 증폭되는 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브; 및 측방유동스트립(lateral flow strip);을 포함하는, 살모넬라 속 균을 검출하기 위한 측방유동검사(lateral flow assay) 키트 및 상기 키트를 이용한 살모넬라 속 균의 검출방법에 관한 것이다.
청구항
번호청구항
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제3항에 있어서, 상기 스페이서는 4~6개의 아데닌(adenine) 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 살모넬라 속 균을 검출하기 위한 측방유동검사 키트.

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제1항에 있어서, 상기 측방유동스트립은 금 나노입자-스트렙트아비딘(streptavidin) 접합체가 처리되어 있는 접합패드(conjugate pad); 항-FITC (fluorescein isothiocyanate) 항체가 고정되어 있는 검사선(test line); 및 알부민-비오틴(biotin) 접합체가 고정되어 있는 대조선(control line);이 구비된 스트립 형태의 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인인 것을 특징으로 하는 살모넬라 속 균을 검출하기 위한 측방유동검사 키트.

1

고리매개등온증폭(loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트; 상기 프라이머 세트에 의해 증폭되는 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브; 및 측방유동스트립(lateral flow strip);을 포함하는, 살모넬라 속 균을 검출하기 위한 측방유동검사(lateral flow assay) 키트.

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제1항에 있어서, 상기 고리매개등온증폭용 프라이머 세트는 서열번호 2 내지 7의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 살모넬라 속 균을 검출하기 위한 측방유동검사 키트.

3

제1항에 있어서, 상기 프로브는 스페이서(spacer), 고리매개등온증폭산물에 특이적인 염기서열, 스페이서 및 비오틴이 순차적으로 연결된 구조인 것을 특징으로 하는 살모넬라 속 균을 검출하기 위한 측방유동검사 키트.

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제1항에 있어서, 상기 살모넬라 속 균은 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 더비(S. derby), 살모넬라 엔테리카(S. enterica), 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis) 또는 살모넬라 보비스모르비피칸스(S. bovismorbificans)인 것을 특징으로 하는 살모넬라 속 균을 검출하기 위한 측방유동검사 키트.

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살모넬라 감염 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료 또는 살모넬라 함유 의심 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 2 내지 7의 염기서열로 이루어진 고리매개등온증폭(loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용하여 고리매개등온증폭 반응으로 표적 서열을 증폭하는 단계; 및상기 증폭 단계의 산물을 측방유동스트립(lateral flow strip)에 적용하여 신호를 검출하는 단계;를 포함하는, 살모넬라 속 균의 검출방법.

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제7항에 있어서, 상기 증폭 단계 산물은 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.1% PVP (poly(vinyl pyrrolidone)) 및 0.02% Tween 20이 함유된 0.05 M PBS (Phosphate-buffered saline)에 4.5~5.5배 희석한 후 측방유동스트립에 적용하는 것을 특징으로 하는 검출방법.

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제7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 비강액, 타액, 콧물, 객담, 뇨 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검출방법.

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제7항에 있어서, 상기 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 고리매개등온증폭용 프라이머는 5' 말단에 FITC (fluorescein isothiocyanate)가 결합된 것을 특징으로 하는 검출방법.

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제7항에 있어서, 상기 프로브는 스페이서(spacer), 고리매개등온증폭산물에 특이적인 염기서열, 스페이서 및 비오틴이 순차적으로 연결된 구조인 것을 특징으로 하는 검출방법.

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제7항에 있어서, 상기 고리매개등온증폭 반응은 57.568.3℃에서 3550분간 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출방법.

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제7항에 있어서, 상기 측방유동스트립은 금 나노입자-스트렙트아비딘(streptavidin) 접합체가 처리되어 있는 접합패드(conjugate pad); 항-FITC (fluorescein isothiocyanate) 항체가 고정되어 있는 검사선(test line); 및 알부민-비오틴(biotin) 접합체가 고정되어 있는 대조선(control line);이 구비된 스트립 형태의 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인인 것을 특징으로 하는 검출방법.

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제13항에 있어서, 상기 항-FITC 항체는 0.5~1.0 ㎎/㎖의 농도로 검사선에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 검출방법.

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제13항에 있어서, 상기 알부민-비오틴 접합체는 0.2~0.8 ㎎/㎖의 농도로 대조선에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 검출방법.

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제7항에 있어서, 상기 살모넬라 속 균은 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 더비(S. derby), 살모넬라 엔테리카(S. enterica), 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis) 또는 살모넬라 보비스모르비피칸스(S. bovismorbificans)인 것을 특징으로 하는 검출방법.