지방축적 저해 효능 평가를 위한 전체 간 세포의 3차원 세포배양 방법
Method of three-dimensional cell culture using primary hepatocyte cell for evaluating the reducing effect of lipid accumulation
특허 요약
본 발명은 향상된 지방축적 저해 효능 평가를 위한 전체 간세포의 3차원 배양 방법에 관한 것으로, 간단한 방법을 통해 분리한 전체 간세포 및 알지네이트를 이용하여 간 조직과 유사한 환경을 가진 인공 간 조직을 제공하고, 따라서 신규 지방산 축적 저해 약물의 효능 평가의 정확도를 향상시킬 수 있으며, 96웰 플레이트 및 마이크로필러를 이용한 3차원 세포배양 방법을 제공함으로서, 인공 간 조직의 대량생산이 가능하다.
청구항
번호청구항
1

a) 분리된 간 조직에서 전체 간세포를 분리하여 전체 간세포를 얻는 단계;b) 상기 전체 간세포를 0.5 X 107 내지 1.5 X 107 cell/ml의 농도로 포함하는 세포 배지를 준비하는 단계;c) 상기 전체 간세포를 포함하는 세포 배지에 ECM(extracellular matrix)을 혼합하여 ECM-세포 혼합물을 얻는 단계;d) 상기 ECM-세포 혼합물을 마이크로필러(micropillar)에 분배(loading)하는 단계;e) 상기 분배된 ECM-세포 혼합물을 포함하는 마이크로필러를 배양 배지가 포함된 웰에 결합 후, 세포를 안정화하여 안정화된 ECM-세포 혼합물을 얻는 단계; 및f) 상기 안정화된 ECM-세포 혼합물을 포함하는 마이크로필러를 새로운 배양 배지가 포함된 웰에 결합하는 단계;를 포함하고,상기 단계 c)의 ECM은 0.5 내지 1.0 (v/v/)% 알지네이트(alginate)인 것을 특징으로 하는, 전체 간세포를 이용한 3차원 세포배양 방법.

2

삭제

3

제1항에 있어서, 상기 단계 a)의 전체 간세포는 간세포(hepatocyte), 간 성상 세포(hepatic stellate cell), 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 대식세포(macrophage)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.

4

제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 세포 배지는 HepatoZYME, BCS, 및 Antibiotics을 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.

5

제1항에 있어서,상기 단계 c)의 포함하는 전체 간세포를 포함하는 세포 배지 및 ECM은 1:1의 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.

6

제1항에 있어서,상기 단계 d)의 마이크로필러(micropillar)에 분배된 ECM-세포 혼합물은 0.5 내지 5 μl인 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.

7

제1항에 있어서, 상기 단계 e)의 배양 배지는 HepatoZYME, BCS, 및 Antibiotics을 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.

8

제1항에 있어서, 상기 단계 e)의 세포 안정화는 37℃ 및 5% CO2에서 20 내지 40분 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.

9

제1항에 있어서, 상기 단계 f)의 배양 배지는 HepatoZYME, BCS, 및 Antibiotics을 포함하는 인 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양 방법.

10

삭제

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하기를 포함하는 지방 축적 감소 물질의 스크리닝 방법:a) 제1항의 방법으로 제조된 3차원 세포배양 배지를 혼합 지방산이 포함된 배지로 교환하여 배양하여 지방이 축적된 3차원 인공 간 조직을 얻는 단계;b) 상기 3차원 인공 간 조직에 지방 축적 감소 후보물질을 접촉시키는 단계; 및c) 상기 단계 b)의 3차원 인공 간 조직의 지방 또는 지질의 양을 측정하는 단계.

12

제11항에 있어서,상기 단계 a)의 혼합 지방산은 포화지방산과 불포화지방산이 1:1 내지 1:3의 비로 혼합된 것이고;상기 포화지방산은 palmitate이고; 및상기 불포화지방산은 oleate인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.

13

제11항에 있어서,상기 지방간 관련 대사질환은 만성 간염, 간경변증, 인슐린 비의존성, 당뇨병, 이상지질혈증, 비만, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증 등을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.