CYP154C4-1 효소의 단백질 결정화 방법 및 이를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법
Method for crystallization of CYP154C4-1 protein and bioconversion method for hydroxylizing steroid using the same
특허 요약
본 발명은 CYP154C4-1 효소, 그 단백질 결정화 방법 및 이를 이용하여 스테로이드의 2번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다. 본 발명의 Streptomyces sp. 유래 CYP154C4-1 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법은 테스토스테론 등의 스테로이드의 생물전환 시 위치특이성이 우수하므로, 단백질 공학 분야에서 인공 스테로이드 관련 CYP 개발 기술로 유용하게 사용될 수 있다.
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CYP154C4-1을 이용하여 스테로이드의 2번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법에 있어서,상기 스테로이드가 테스토스테론이고, 상기 히드록시화가 산화・환원 단백질 페레독신(ferredoxin, Fdx) 및 페레독신 환원 효소(ferredoxin reductase, Fdr)를 이용한 NADPH 의존성 시스템 존재 하에서 수행되며, 상기 NADPH 의존성 시스템이 글루코스 6-포스페이트, 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제 및 카탈라제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고, 상기 히드록시화가 다이아세톡시요오드벤젠 또는 H2O2의 산화제 존재 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.

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제1항에 있어서, 상기 Fdx가 0.1 내지 100 μM이고, Fdr이 0.01 내지 10 U인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.

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제1항에 있어서, 상기 NADPH가 0.01 내지 10 mM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.

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제1항에 있어서, 상기 다이아세톡시요오드벤젠이 0.1 내지 50 mM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.

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제1항에 있어서, 상기 H2O2가 1 내지 100 mM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.

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제1항에 있어서, 상기 CYP154C4-1가 0.1 내지 100 μM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.

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서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 공간군(space group) I212121에 속하고, 비대칭 유닛에 단일 분자를 포함하고, 유닛-셀 파라미터가 a = 83.755 Å, b = 115.032 Å, c = 127.807 Å, a = b = c = 90°인 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질 결정.

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제13항에 있어서, 상기 CYP154C4-1 효소 단백질 결정이 21개 α-헬릭스 및 6개 β-스트랜드를 포함하는 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질 결정.

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(1-a) PEG3350, 리튬 설페이트 및 Bis-Tris-HCl을 포함하는 저장 용액과 (1-b) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질 용액을 서로 혼합하여 결정화시키는 단계를 포함하는, 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질의 결정화 방법.

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제15항에 있어서, 상기 저장 용액이 5% 내지 45%(w/v)의 PEG3350, 0.02 내지 0.5 M 리튬 설페이트 및 0.01 내지 0.5 M Bis-Tris-HCl을 포함하는 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질의 결정화 방법.

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제15항에 있어서, 상기 저장 용액이 pH 5.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질의 결정화 방법.