siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체 및 이의 제조방법
Polymeric siRNA-Glycol Chitosan Nanocomplex for Tumor-targeted Delivery of siRNA and Method for Preparing the Same
특허 요약
본 발명은 종양세포 내에서 특정 유전자의 발현을 억제하기 위한 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한, siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체는 종양세포에 대하여 향상된 siRNA 전달능을 가지며, 전달된 siRNA에 의한 표적 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다.
청구항
번호청구항
1

양전하를 띄는 글리콜 키토산 및 음전하를 띄는 siRNA 다량체를 포함하는 100 내지 200 nm 직경을 갖는 구형의 나노입자로,상기 siRNA 다량체는 롤링 서클 트랜스크립션을 통해 제조된, 센스 및 안티센스 가닥이 서로 헤어핀 구조를 형성하며 길게 연결되어 있는 50-2000 bp 크기를 갖는 것이며,상기 글리콜 키토산과 siRNA 다량체는 전기적 상호작용에 의해 서로 결합되고,상기 양전하를 띄는 글리콜 키토산은 아민기의 일부가 하기 [구조식 1]로 표시되는 작용기 중 어느 하나로 치환된 것이며,상기 양전하를 띄는 글리콜 키토산은 상기 작용기 간의 공유결합을 통해 서로 가교결합되는 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체:[구조식 1] ,

2

제1항에 있어서,상기 양전하를 띄는 글리콜 키토산은 하기 [화학식 1]로 표시되는 구조인 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체:[화학식 1]상기 [화학식 1]에서,상기 R1은 아세틸기 또는 수소이며,상기 R2는 하기 [구조식 1]로 표시되는 작용기 중에서 선택된 어느 하나이며,상기 x, y는 1 내지 1000의 정수이며,이들의 몰%는 0.5≤x≤0.95, 0.05≤y≤0.5이며,n은 10 내지 5000의 정수이다.[구조식 1] ,

3

제1항에 있어서,상기 글리콜 키토산의 분자량은 25,000 이상인 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체.

4

제1항에 있어서,상기 siRNA 다량체는 VEGF-A(vascular endothelial growth factor-A)의 mRNA에 상보적이며, VEGF-A 유전자의 발현을 억제하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체.

5

제1항에 있어서,상기 siRNA 다량체는 하기 [서열번호 1] 및 이에 상보적인 [서열번호 2] 의 염기서열을 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체.[서열번호 1] VEGF siRNA: sense5’-GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3’[서열번호 2] VEGF siRNA: antisense strand5’-GAUCUCAUCAGGGUACUCC-3’

6

제1항에 있어서,상기 음전하를 띄는 siRNA 다량체과 양전하를 띄는 글리콜 키토산의 질량비는 1 : 1.4-14인 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체.

7

제1항에 있어서,상기 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체의 직경은 100 내지 300 ㎚인 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체.

8
  1. siRNA의 센스 및 안티센스 가닥에 대한 상보적 염기서열을 포함하는 DNA와 상기 DNA의 양 말단에 T7 프로모터가 결합할 수 있는 상보적 염기서열을 포함하는 원형의 DNA 주형을 합성하는 단계;2) 상기 원형 DNA 주형으로부터 롤링 서클 트랜스크립션(Rolling Circle Transcription, RCT)을 통해 siRNA 다량체를 수득하는 단계;3) 글리콜 키토산의 아민기의 일부를 하기 [구조식 1]로 표시되는 작용기 중 어느 하나로 치환하여 양전하를 띄는 글리콜 키토산을 제조하는 단계; 및4) 상기 2) 단계에서 수득한 음전하를 띄는, 센스 및 안티센스 가닥이 서로 헤어핀 구조를 형성하며 길게 연결되어 있는 50-2000 bp 크기의 siRNA 다량체와 상기 3) 단계에서 수득한 양전하를 띄는 글리콜 키토산을 반응시켜, 양전하를 띄는 글리콜 키토산 및 음전하를 띄는 siRNA 다량체를 포함하는 구형의 나노입자를 제조하는 단계;를 포함하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체의 제조방법:[구조식 1] ,
9

제8항에 있어서,상기 2) 단계의 롤링 서클 트랜스크립션의 프로모터는 T7 프로모터가 사용되며, RNA 중합효소는 T7 중합효소가 사용되는 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체의 제조방법.

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제8항에 있어서,상기 2) 단계의 롤링 서클 트랜스크립션 과정에서의 반응 시간, 반응 온도, 원형 DNA 주형의 농도, RNA 중합효소의 농도 조절을 통해 siRNA 다량체의 수득율을 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체의 제조방법.

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제8항에 있어서,상기 4) 단계에서 siRNA 다량체와 글리콜 키토산은 전기적 상호작용에 의해 양전하를 띄는 글리콜 키토산과 음전하를 띄는 siRNA 다량체가 서로 결합되는 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체의 제조방법.

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제8항에 있어서,상기 4) 단계에서 상기 양전하를 띄는 글리콜 키토산은 상기 작용기 간의 공유결합을 통해 서로 가교결합되는 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체의 제조방법.

13

제8항에 있어서,상기 양전하를 띄는 글리콜 키토산은 하기 [화학식 1]로 표시되는 구조인 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체의 제조방법:[화학식 1]상기 [화학식 1]에서,상기 R1은 아세틸기 또는 수소이며,상기 R2는 하기 [구조식 1]로 표시되는 작용기 중에서 선택된 어느 하나이며,상기 x, y는 1 내지 1000의 정수이며,이들의 몰%는 0.5≤x≤0.95, 0.05≤y≤0.5이며,n은 10 내지 5000의 정수이다.[구조식 1] ,

14

제8항에 있어서,상기 4) 단계에서 상기 양전하를 띄는 siRNA 다량체와 상기 음전하를 띄는 글리콜 키토산의 질량비는 1 : 1.4-14인 것을 특징으로 하는 siRNA 다량체-글리콜 키토산 나노복합체의 제조방법.

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