N-말단의 일부가 절단된 ATF6β 단백질을 이용한 소포체 스트레스 조절 물질 스크리닝 방법
Method for screening modulators of endoplasmic reticulum stress using ATF6β N-terminal deletion variant
특허 요약
본 발명은 N-말단의 일부가 절단된 ATF6β 단백질을 이용한 소포체 스트레스 조절 물질 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 내재적 ATF6β의 단백질 분해성 절단을 모니터링할 수 있는 루시퍼라제 리포터 세포주를 개발하였다. 상기 세포주는 합성 전사인자 도메인 및 인간 ATF6β N-말단 결실 변이를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. ER 스트레스 하에서, 루시퍼라제 리포터 유전자의 5XGAL4-결합 사이트가 안정적으로 삽입된 HeLa 루시퍼라제 리포터(HeLa Luciferase Reporter; HLR) 세포 내에서, 전사 활성화제(trans-activator) 단편은 S1P- 및 S2P-매개 절단을 통해 제작되었다. HLR 세포 내에서 합성 전사 활성화 인자는 반딧불 루시퍼라제 유전자의 발현을 효과적이고 강력하게 유도하였다. 이에, 본 발명은 시험 물질 처리에 따른 ATF6β 활성 및 소포체 스트레스 정도를 측정할 수 있어, 소포체 스트레스 조절 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.
청구항
번호청구항
1

프로모터 유전자; GAL4 DNA 결합 도메인(GAL4 DNA binding domain; GAL4DBD) 및 VP16 전사 활성화 도메인 (VP16 trans-activation domain; VP16AD)이 융합된 전사 활성화 인자(trans-activator)를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 N-말단의 일부가 절단된 ATF6β 단백질 단편을 코딩하는 유전자를 순서대로 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 재조합 리포터 세포주.

2

제1항에 있어서, 상기 GAL4DBD는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 VP16AD는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 리포터 세포주.

3

제1항에 있어서, 상기 GAL4DBD 및 VP16AD가 융합된 전사 활성화 인자(trans-activator)는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 리포터 세포주.

4

삭제

5

제1항에 있어서, 상기 프로모터 유전자는 CMV 프로모터 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 리포터 세포주.

6

삭제

7

제1항에 있어서, 상기 재조합 리포터 세포주는 HeLa 루시퍼라제 리포터(HeLa Luciferase Reporter; HLR) 세포주인 것을 특징으로 하는 재조합 리포터 세포주.

8

제7항에 있어서, 상기 HLR 세포주는 GAL4-결합 사이트가 반복되어 이루어진 프로모터 유전자 및 루시퍼라제 리포터 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 리포터 세포주.

9

제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리포터 세포주를 포함하는 ATF6β 활성 측정용 조성물.

10

제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리포터 세포주를 포함하는 소포체 스트레스 수준 측정용 조성물.

11

(1) 제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리포터 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및(2) 상기 시험물질을 접촉시킨 재조합 리포터 세포주에서 리포터의 신호 세기를 측정하는 단계를 포함하는 시험물질 내 ATF6β 활성 측정 방법.

12

(1) 제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리포터 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및(2) 상기 시험물질을 접촉시킨 재조합 리포터 세포주에서 리포터의 신호 세기를 측정하는 단계를 포함하는 시험물질 내 소포체 스트레스 수준 측정 방법.

13

제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리포터 세포주를 포함하는 ATF6β 활성 촉진제 또는 ATF6β 활성 억제제 스크리닝용 조성물.

14

제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리포터 세포주를 포함하는 소포체 스트레스 촉진제 또는 소포체 스트레스 억제제 스크리닝용 조성물.

15

(1) 제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리포터 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계;(2) 상기 시험물질을 접촉시킨 재조합 리포터 세포주에서 리포터의 신호 세기를 측정하는 단계; 및(3) 대조군 시료와 비교하여 상기 리포터의 신호 세기가 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 ATF6β 활성 촉진제 스크리닝 방법.

16

(1) 제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리포터 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계;(2) 상기 시험물질을 접촉시킨 재조합 리포터 세포주에서 리포터의 신호 세기를 측정하는 단계; 및(3) 대조군 시료와 비교하여 상기 리포터의 신호 세기가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 ATF6β 활성 억제제 스크리닝 방법.

17

(1) 제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리포터 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계;(2) 상기 시험물질을 접촉시킨 재조합 리포터 세포주에서 리포터의 신호 세기를 측정하는 단계; 및(3) 대조군 시료와 비교하여 상기 리포터의 신호 세기가 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 소포체 스트레스 촉진제 스크리닝 방법.

18

(1) 제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리포터 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계;(2) 상기 시험물질을 접촉시킨 재조합 리포터 세포주에서 리포터의 신호 세기를 측정하는 단계; 및(3) 대조군 시료와 비교하여 상기 리포터의 신호 세기가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 소포체 스트레스 억제제 스크리닝 방법.

도면대표도면