고순도 재조합 프리온 단백질의 대량 생산 방법
Mass Production Method for Recombinant Prion Protein with High Purity
특허 요약
본 발명은 재조합 프리온 단백질을 고순도로 대량 생산하는 방법에 관한 것으로 본 발명의 일 예에 따른 상기 대량 생산 방법은 재조합 프리온 단백질 발현, 봉입체 수득, 봉입체 용해, 재접힘 및 정제 과정을 포함하며, 생산된 재조합 프리온 단백질은 병원성 프리온 단백질과 접촉시 비정상적 접힘 구조를 나타낼 수 있다.
청구항
번호청구항
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(a) 재조합 프리온 단백질 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 단백질 발현을 유도하는 단계;(b) 배양된 대장균을 분쇄하여 재조합 프리온 단백질 봉입체(inclusion body)를 수득하는 단계;(c) 수득한 재조합 프리온 단백질 봉입체를 세척 버퍼로 세척하는 단계;(d) 세척한 재조합 프리온 단백질 봉입체에 가용화버퍼(solubilization buffer)를 첨가하여 봉입체를 용해시키는 단계;(e) 용해된 재조합 프리온 단백질에 재접힘 버퍼(refolding buffer)를 첨가하여 재접힘을 유도하는 단계; 및(f) 재접힘된 재조합 프리온 단백질을 친화도 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피로 정제하는 단계;를 포함하고,상기 세척 버퍼는 1 내지 50 mM 트리스, 0.1 내지 2 mM EDTA, 0.005% 내지 0.05% 리소자임, 0.1% 내지 5% 트리톤 X-100 및 0.01 내지 3.0 M 요소를 포함하고,상기 양이온 교환 크로마토그래피는1 내지 15 M 요소 및 0.05 내지 0.5 M 아세트산으로 이루어진 pH 0.5 내지 5 범위의 버퍼 A; 및1 내지 15 M 요소, 0.05 내지 0.5 M 아세트산 및 0.1 내지 3 M 염화나트륨으로 이루어진 pH 0.5 내지 5 범위의 버퍼 B로 수행되는, 재조합 제방쥐 프리온 단백질의 생산 방법.

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제1항에 있어서, 상기 (d)의 가용화 버퍼는 요소 및 글리신을 포함하는 염기성 버퍼인 것인, 재조합 프리온 단백질의 생산 방법.

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제1항에 있어서, 상기 (e)의 재접힘 버퍼는 요소, 글리신 및 β-멀캅토에탄올을 포함하는 염기성 버퍼인 것인, 재조합 프리온 단백질의 생산 방법.

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제1항에 있어서, 상기 (f)의 친화도 크로마토그래피는 트리스, 염화나트륨, 글리세롤로 이루어진 결합 버퍼 및 트리스, 염화나트륨, 글리세롤 및 이미다졸로 이루어진 용출 버퍼로 수행되는 것인, 재조합 프리온 단백질의 생산 방법.

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제1항에 있어서, 상기 (f)의 역상 크로마토그래피는 증류수에 희석된 트리플루오로아세트산(TFA) 용액 및 아세트니트릴에 희석된 트리플루오로아세트산 용액으로 수행되는 것인, 재조합 프리온 단백질의 생산 방법.

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