개의 TP53 유전자 표적 CRISPR/Cas9 벡터 시스템 및 이를 이용한 TP53 넉아웃 세포
Canine TP53-targeting CRISPR/Cas9 vector system and TP53 knock-out cell using the vector system
특허 요약
본 발명은 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템을 활용하여 개 모델에서 대표적인 종양 억제 유전자인 TP53 유전자를 특이적으로 표적하는 기술과 이를 적용하여 구축한 TP53 넉아웃 (knock-out) 개 세포주 및 이를 종양 연구에 활용하는 기술에 관한 것이다. 본 발명의 가이드 RNA (gRNA)는 개의 TP53 유전자만을 특이적으로 표적할 수 있는바, 이러한 특정 gRNA를 CRISPR/Cas9 시스템에 도입하는 경우 오프-타겟 효과(off-target effect) 없이 개의 TP53 유전자를 특이적으로 넉아웃(knock-out) 시킬 수 있다. 따라서, 개의 TP53 유전자를 특이적으로 표적하는 gRNA가 적용된 CRISPR/Cas9 시스템은 TP53 신호체계 불활성화와 관련된 다양한 종양 관련 연구를 위한 개 세포 모델과 동물모델을 제작하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 개 TP53 유전자-특이적 CRISPR/Cas9 시스템으로 구축한 TP53 넉아웃 세포는 개의 종양과 관련된 다양한 종양유전자의 종양 생성 및 악성화 기전연구를 위한 연구 모델과 이와 관련한 항암제 테스트 모델로 활용할 수 있다.
청구항
번호청구항
14

제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 세포주를 동물의 피하에 이식하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 종양형성 동물모델 제조방법.

1

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 가이드 RNA(guide RNA); 및 Cas 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 개의 TP53 유전자 타겟팅용 재조합 벡터.

2

제1항에 있어서,상기 Cas 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 Cas9 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.

3

제1항에 있어서,상기 Cas 단백질은 NGG 트리뉴클레오타이드(trinucledotide)와 도입한 가이드 RNA 서열에 상보적인 염기서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.

4

제1항에 있어서,상기 벡터는 형광단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함하는 재조합 벡터.

5

제1항의 재조합 벡터가 도입된, 형질전환 세포주.

6

제5항에 있어서,상기 세포주는 종양유전자 과발현 벡터가 추가로 도입된, 형질전환 세포주.

7

제6항에 있어서,상기 종양유전자는 RAS 유전자인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포주.

8

제5항에 있어서,상기 세포주는 개의 종양형성 세포 모델인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포주.

9

제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 개 유래 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 형질전환 세포주 제조방법.

10

제9항에 있어서,상기 세포는 개 유래의 접합체(zygote), 섬유아세포, 신경계 세포, 피부세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포주 제조방법.

11

제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 세포주에 항암제 후보물질을 처리하는 단계; 및상기 후보물질을 처리한 세포주를 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 종양형성이 개선되거나 치료되는 경우 이를 항암제로 판단하는 단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법.

12

제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 세포주가 이식되어 종양이 형성된, 인간을 제외한 종양형성 동물모델.

13

제12항에 있어서,상기 동물모델은 개의 TP53 유전자가 넉아웃된 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 종양형성 동물모델.

15

제12항의 동물모델에 항암제 후보물질을 투여하는 단계; 및상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 종양형성이 개선되거나 치료되는 경우 이를 항암제로 판단하는 단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법.