□ 연구가설 1. ALT+ 암세포에서 유비퀴틴-PCNA가 텔로미어 손상 유도를 통해서 BIR을 개시한다. PCNA 탈유비퀴틴화(deubiquitination) 및 언로딩에 관여하는 ATAD5 단백질을 고갈시켰을 경우, ALT+ U2OS 암세포에서 텔로미어 길이 및 여러 ALT 표현형이 ATAD5 또는 ATAD5에 의해 소집되는 PCNA 탈유비퀴틴화 효소 USP1 고갈 시 늘어남을 관찰하였다. ALT+ 암세포에서 복제 스트레스에 의해 텔로미어 손상이 증가했을 때 그 수가 증가한다고 보고된 ALT-연관-피엠엘 체(ALT-associated PML body, 이하 APB) 개수가 PCNA 탈유비퀴틴화에 관여하는 ATAD5 또는 USP1 고갈 시 APB 수가 증가하는 반면에, PCNA 유비퀴틴화 효소 RAD18 고갈 시에 그 수가 감소함을 확인하였다. 이러한 결과들로부터 유비퀴틴-PCNA가 텔로미어 손상을 유도해서 BIR 촉진 및 ALT 텔로미어 연장으로 이어진다는 연구가설 1을 설정하였고, 아래의 연구 내용을 수행할 계획이다. □ 연구내용 1. 유비퀴틴-PCNA의 텔로미어 손상 유도 확인 - 유비퀴틴-PCNA의 APB 국소화 및 탈유비퀴틴화 효소 고갈 효과 확인 - 유비퀴틴-PCNA 양이 텔로미어 손상에 미치는 효과 확인 - RAD52 고갈이 텔로미어 손상 및 APB 형성에 미치는 영향 분석 □ 연구가설 2. ALT+ 암세포에서 중합유비퀴틴-PCNA-SLX4가 BIR 개시를 위한 텔로미어 절단을 유도한다. 복제 스트레스 시 형성되는 단일유비퀴틴-PCNA가 BIR 유도를 위한 텔로미어 절단과 관련 없음을 확인하였다. 이전 연구에 의하면, 중합유비퀴틴 사슬이 특정 DNA 상해 부위로 SLX4 및 이와 결합하는 뉴클레아제(nuclease)들을 소집해서 상해 복구를 위한 DNA 절단을 유도하는데, USP1 고갈에 인해 증가한 APB 수가 SLX4 고갈에 의해 다시 감소함을 확인하였다. 이 결과로부터 중합유비퀴틴-PCNA가 SLX4-뉴클레아제를 텔로미어로 소집해서 DNA 절단을 유도하여 BIR을 촉진한다는 연구가설 2를 설정하였고, 아래의 연구 내용을 수행할 계획이다. □ 연구내용 2. 중합유비퀴틴-PCNA-SLX4의 텔로미어 절단 유도 기작 규명 연구 - 유비퀴틴-PCNA 양이 SLX4의 텔로미어 국소화에 미치는 효과 확인 - PCNA 중합유비퀴틴화 저해의 텔로미어 손상 및 APB 형성에 대한 영향 분석 - SLX4 결합 뉴클레아제 고갈 효과 확인 □ 연구가설 3. 유비퀴틴-PCNA가 ALT 텔로미어의 BIR 과정을 촉진한다. 복제 스트레스 상황에서 텔로미어에서 관찰되는 체세포분열기 DNA 합성(mitotic DNA synthesis, 이하 MiDAS)은 BIR 과정을 통해 일어난다. ATAD5를 고갈시킨 경우, 텔로미어 MiDAS가 ALT+ U2OS 암세포에서 특이적으로 늘어남을 확인하였다. 또한 텔로미어 MiDAS의 증가가 USP1 고갈 시에도 관찰되며, RAD18 고갈에 의해 PCNA 유비퀴틴화를 감소시킨 경우에는 반대로 감소함을 확인하였다. 이러한 결과들로부터 유비퀴틴-PCNA가 ALT 텔로미어에서 BIR 유도뿐만 아니라 BIR 과정을 촉진한다는 연구 가설 3을 설정하였고, 아래의 연구 내용을 수행할 것이다. □ 연구내용 3: 유비퀴틴-PCNA의 ALT 텔로미어 BIR 과정 촉진 과정 규명 - 유비퀴틴-PCNA가 절단-유도-텔로미어-DNA-합성에 미치는 효과 확인 - 유비퀴틴-PCNA의 절단-유도-텔로미어 국소화 및 탈유비퀴틴화 저해 효과 확인