?말라리아원충의 저분자화합물 수송체를 클로닝 및 기능을 규명 ?해당 수송체의 과발현 세포주 확립과 기능 해석 ?동일한 기능을 갖는 사람의 유전자를 발굴하여 유전자 과발현 세포주 확립 ?원충과 사람 수송체의 기능적 차이를 규명 ?새로운 치료약의 후보를 발굴할 수 있는 스크리닝계의 확립이 본 연구의 최종 목표임.

말라리아와 톡소포자충증을 유발하는 기생충들은 첨복포자충류에 포함된다. 그들 중 일부는 자유생활 형태에서 세포 내 기생충인 열원충종으로 진화하였다. 열원충은 말라리아의 가장 중요한 원인이며, 매년 백만 명이 넘는 어린이의 목숨을 앗아 간다. 그들은 많은 생합성 경로를 상실하였고 영양 공급원으로 숙주에 의존하게 되었다. 본 연구에서는 북한형 3일열원충의 6탄당 수송에 대한 이해를 높이기 위해 육탄당 수송체(PvHTNK)를 단리하고, 그 기능을 규명하였다. 본 교실에서 수 년전 수행한 원생병원체 소재은행 과제시 확보한 삼일열 말라리아 환자 혈액 200 ㎕에 혈액용 Rri-reagent 500 ㎕를 가해 용해시키고, 100 ㎕의 클로로포름을 첨가하여 교반 후 13,500 rpm으로 원심분리하여 얻은 상청액에 2-propanol 400 ㎕를 가해 원심분리 후 얻어진 침전물을 70% 에탄올 1 ml로 세척하고 건조하여 total RNA를 확보한다. primer로 oligo dT를 이용하여 역전자 반응을 통하여 cDNA를 확보한다. cDNA를 주형으로 NCBI database에서 확보한 염기서열을 참고하여 제작한 primer를 이용하여 TAKARA사의 EX taq polymerase로 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 50초로 35 cycle PCR 및 얻어진 PCR 산물들을 주형으로 하여 sense 1 primer와 최종 primer set의 anitisense primer로 overlap extension PCR을 이용하여 그 산물을 TA cloning vector에 subcloning 한 후 염기서열을 확인하여full length의 유전자를 확보한다. 확보된 전장의 유전자를 pBluescript II(-) vector에 subcloning 한 후 cRNA를 합성한다.합성한 cRNA를 아프리카발톱개구리의 난모세포에 주입하여 [3H]deoxy-D-glucose를 이용하여 수송능을 조사하였다. 미국 국립생물공학정보센터의 데이터베이스의 PvHTNK유전자 정보를 확인한 후, 국내 삼일열말라리아 감염 환자의 혈액으로부터 역전사 중합효소 연쇄반응을 통하여 확보하였다. PvHTNK 유전자는 1509개의 염기쌍으로 이루어져 있으며 502개의 아미노산을 암호화하였다. 단백질의 소수성 분석을 통하여 PvHTNK는 12개의 막 관통 부위를 가지고 있었다. 이 유전자를 아프리카발톱개구리의 난모세포에 발현시켰을 때, 방사성동위원소 표지 deoxy-D-glucose ([3H]DDG)의 수송을 나트륨이온 의존성이 없이 발현시간 및 배양시간 의존적으로 증가시켰다. 기질 유출 실험으로부터 PvHTNK 에 의한 포도당의 교환 모드는 관찰되지 않았다. 기질 농도 의존성 수송실험의 결과 [3H]DDG의 수송은 Michaelis-Menten 방정식에 따르는 포화 곡선을 보여주었다. Lineweaver-Burk 방정식 분석에서는 [3H]DDG에 대하여 Km 값은 294.1 μM이었고 Vmax 값은 1,060 pmol/oocyte/hour임을 보여주었다. 6탄당을 이용한 억제실험으로부터 포도당, 만노즈, DDG는 강한 억제작용을 나타내었고, methyl–D-glucose는 약한 억제효과를 보였다. DDG, 포도당, 만노스 및 methyl-D-glucose와 같은 기질은 각각 1.20 ± 0.19 mM, 0.26 ± 0.01 mM, 0.25 ± 0.02 mM, and 0.40 ± 0.06 mM의 IC50값을 보여주었다. 이러한 결과는 삼일열원충의 탄수화물 대사에 대한 분자생물학적 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료 되었다.

본 과제는 간흡충 치료약물 개발을 위해 생체에서 유기화합물을 수송하는 수송체단백질 major facilitator superfamily: MFS를 클로닝하고 분석하는 연구임. 연구목표는 MFS의 수송유형 및 동력학(transport mode and kinetics)을 규명하여 치료약물개발 후보물질의 효능 탐색계를 확립하는 데 있음. 연구내용은 낙동강유역 참붕어 채집, 0.6% pepsin·0.7% HCl pH2.0 인공소화로 피낭유충 획득, 토끼 경구투여 후 성충 확보, mRNA 분리 및 cDNA library 제작, NCBI database 기반 MFS 후보 coning, cRNA 주입 후 난모세포 수송능 분석, eukaryotic expression vector subcloning 및 HEK293·CHO 과발현 영구세포주 확립 수행임. 기대효과는 수송특성 이해, 특이적 억제제 개발, chemical bank screening 및 세포주 기반 양적 탐색 용이성, 간흡충 외 기생충·원충 응용 가능성 제공임.

본 과제는 간흡충 치료약물 개발을 위해 생체에서 필수 유기화합물을 옮기는 수송체단백질 major facilitator superfamily(MFS)들을 클로닝하는 연구임. 연구 목표는 MFS의 transport mode and kinetics를 규명해 후보물질의 효능 탐색계를 확립하는 데 있음. 핵심 연구 내용은 감염률 높은 낙동강유역 참붕어에서 피낭유충을 인공소화로 확보한 뒤 토끼에 경구투여하고 간에서 성충을 확보하여 mRNA 기반 cDNA library 제작, NCBI 참고 MFS 후보 coning, 염기서열 확인 및 cRNA 제작 후 아프리카발톱개구리 난모세포에서 수송능 분석, eukaryotic expression vector subcloning 및 HEK293/CHO 과발현 영구세포주 확립 진행임. 기대 효과는 수송특성 이해, 수송체 특이 억제제 개발을 통한 선택적 치료 성취, chemical bank screening 및 세포주 기반 양적 탐색계 확보이며 간흡충 외 기생충·원충으로 응용 가능함.