1차년도: 세포유입성 항-DNA IgG 자가항체에 의한 염증반응에 있어서 TRIM21과 β-TrCP2 분자의 상호작용 기전 규명 - HEK293f 세포의 현탁배양을 이용한 세포유입성 모델 항체 단백질 (3D8 IgG)의 정제 - 사람의 면역세포 및 비면역세포 (THP-1 및 HEK293T)에서, 항체 단백질의 세포내 유입 시 TRIM21의 auto-ubiquitination 분석 - 항체 단백질의 세포내 유입 시 TRIM21에 의한 β-TrCP2의 ubiquitination 분석 - 항체 단백질의 세포내 유입 시 β-TrCP2에 의한 TRIM21의 ubiquitination 분석 - 세포내로 유입된 항체 단백질의 ubiquitination 분석 - TRIM21 wild type (wt) 및 β-TrCP2 wt의 과발현 또는 녹다운에 의한 염증성 싸이토카인 (IL-8, TNF-α)의 분비변화 분석 - TRIM21에서 E3 ligase 활성을 없앤 TRIM21△RING 분자의 클로닝 및 세포질에서 발현시키기 위한 벡터 제작 - TRIM21에 결합 못하는 3D8 IgG (IgG-H433A) 항체 단백질 생산 - β-TrCP2에서 E3 ligase 활성을 없앤 변이체 (β-TrCP2/R447A, β-TrCP2/DF) 분자의 클로닝 및 세포질에서 발현시키기 위한 벡터 제작 - TRIM21 또는 β-TrCP2의 mutants를 발현하는 세포에서, TRIM21, β-TrCP2, 및 세포 내 유입 항체의 ubiquitination 분석 - TRIM21 또는 β-TrCP2의 mutants를 발현하는 세포에서, 항체의 세포내 유입에 의한 염증성 싸이토카인 (IL-8, TNF-α) 분비변화 분석 2차년도: β-TrCP2, TRIM21, 및 IgG 항체 단백질 생산을 통한 상호결합 특성 분석 - β-TrCP2와 IgG 항체 단백질간의 결합 방식(직, 간접결합) 분석 - In silico 모델링을 이용하여, β-TrCP2 분자에 의해 인식되는 IgG 항체의 Fc 부위 예측 - IgG(Fc)에 결합하지 않는 후보 β-TrCP2 mutants의 클로닝, HEK293f 세포의 현탁배양을 이용한 단백질 생산, 및 세포에서의 실험적 검증 - In silico 모델링을 이용하여, IgG의 Fc 부위를 인지하는 β-TrCP2 분자 부위 예측 - β-TrCP2에 결합하지 않는 후보 IgG-Fc mutants의 클로닝, HEK293f 세포의 현탁배양을 이용한 단백질 생산(정제), 및 세포에서의 실험적 검증 - 최종적으로 선발된 β-TrCP2 mutant의 세포질 발현 및 IgG-Fc mutant 단백질의 세포처리를 통하여, 세포유입성 IgG 항체에 의한 염증반응에 있어서 TRIM21과 β-TrCP2 분자의 작용기전 규명 실험을 재검증 - TRIM21 단백질 (wt, mut, 또는 활성 단편)과 β-TrCP2 단백질 (wt, mut, 또는 활성 단편), IgG 항체 단백질 (wt. mutants) 간의 결합 특성 (친화도, 경쟁여부) 분석 3차년도: β-TrCP2 표적으로 하는 염증반응조절 물질 발굴 - β-TrCP2와 IgG의 결합을 저해할 수 있는 물질(약물)을 발굴하기 위한 스크리닝 방법 확립 - 사람 단핵구에서 발굴된 물질의 항염효능을 평가 - 루푸스 동물모델 (MRL-lpr 마우스, NZB/NZW F1 마우스)을 이용한 항염효능평가

1차년도: 세포유입성 항-DNA IgG 자가항체에 의한 염증반응에 있어서 TRIM21과 β-TrCP2 분자의 상호작용 기전 규명 - HEK293f 세포의 현탁배양을 이용한 세포유입성 모델 항체 단백질 (3D8 IgG)의 정제 - 사람의 면역세포 및 비면역세포 (THP-1 및 HEK293T)에서, 항체 단백질의 세포내 유입 시 TRIM21의 auto-ubiquitination 분석 - 항체 단백질의 세포내 유입 시 TRIM21에 의한 β-TrCP2의 ubiquitination 분석 - 항체 단백질의 세포내 유입 시 β-TrCP2에 의한 TRIM21의 ubiquitination 분석 - 세포내로 유입된 항체 단백질의 ubiquitination 분석 - TRIM21 wild type (wt) 및 β-TrCP2 wt의 과발현 또는 녹다운에 의한 염증성 싸이토카인 (IL-8, TNF-α)의 분비변화 분석 - TRIM21에서 E3 ligase 활성을 없앤 TRIM21△RING 분자의 클로닝 및 세포질에서 발현시키기 위한 벡터 제작 - TRIM21에 결합 못하는 3D8 IgG (IgG-H433A) 항체 단백질 생산 - β-TrCP2에서 E3 ligase 활성을 없앤 변이체 (β-TrCP2/R447A, β-TrCP2/DF) 분자의 클로닝 및 세포질에서 발현시키기 위한 벡터 제작 - TRIM21 또는 β-TrCP2의 mutants를 발현하는 세포에서, TRIM21, β-TrCP2, 및 세포 내 유입 항체의 ubiquitination 분석 - TRIM21 또는 β-TrCP2의 mutants를 발현하는 세포에서, 항체의 세포내 유입에 의한 염증성 싸이토카인 (IL-8, TNF-α) 분비변화 분석 2차년도: β-TrCP2, TRIM21, 및 IgG 항체 단백질 생산을 통한 상호결합 특성 분석 - β-TrCP2와 IgG 항체 단백질간의 결합 방식(직, 간접결합) 분석 - In silico 모델링을 이용하여, β-TrCP2 분자에 의해 인식되는 IgG 항체의 Fc 부위 예측 - IgG(Fc)에 결합하지 않는 후보 β-TrCP2 mutants의 클로닝, HEK293f 세포의 현탁배양을 이용한 단백질 생산, 및 세포에서의 실험적 검증 - In silico 모델링을 이용하여, IgG의 Fc 부위를 인지하는 β-TrCP2 분자 부위 예측 - β-TrCP2에 결합하지 않는 후보 IgG-Fc mutants의 클로닝, HEK293f 세포의 현탁배양을 이용한 단백질 생산(정제), 및 세포에서의 실험적 검증 - 최종적으로 선발된 β-TrCP2 mutant의 세포질 발현 및 IgG-Fc mutant 단백질의 세포처리를 통하여, 세포유입성 IgG 항체에 의한 염증반응에 있어서 TRIM21과 β-TrCP2 분자의 작용기전 규명 실험을 재검증 - TRIM21 단백질 (wt, mut, 또는 활성 단편)과 β-TrCP2 단백질 (wt, mut, 또는 활성 단편), IgG 항체 단백질 (wt. mutants) 간의 결합 특성 (친화도, 경쟁여부) 분석 3차년도: β-TrCP2 표적으로 하는 염증반응조절 물질 발굴 - β-TrCP2와 IgG의 결합을 저해할 수 있는 물질(약물)을 발굴하기 위한 스크리닝 방법 확립 - 사람 단핵구에서 발굴된 물질의 항염효능을 평가 - 루푸스 동물모델 (MRL-lpr 마우스, NZB/NZW F1 마우스)을 이용한 항염효능평가

본 과제는 두류(콩·팥)와 감자 종자전염 바이러스의 감염실태를 파악하고 특성을 분석해 피해를 줄이기 위한 연구임. 연구목표는 저비용 현장진단키트 개발을 위한 항체은행 및 생산 시스템 구축, 종자전염 바이러스병 피해해석과 후세대 영향 구명임. 핵심 연구내용은 두류·감자 바이러스 발생현황(용도·지역·품종) 조사, 분리주 확보 및 동정, 생물학적·분자생물학적 특성 구명, 두류 개별·다중진단법 및 생육단계 발현 특성 분석, 차세대 미니항체 선발·미니항체 발현 및 생산기술 확립, 시험관내 항체를 활용한 현장진단키트 생산임. 기대효과는 무병종자 생산 기반, 내병성 육종 기여, 외래·돌발 바이러스 대응 신속화, 수입대체 및 진단 산업 활성화, 저비용·고효율 키트 대량생산을 통한 농업 피해 최소화 및 안정적 생산 기여임

본 과제는 항인플루엔자 효능을 높이기 위해 항바이러스 단백질을 분말화하고 운반체를 적용해 닭 호흡기에서 전달 효과를 검증하는 연구임. 연구 목표는 항바이러스 단백질 운반체를 이용한 향상된 항인플루엔자 효능과 분말화 제형의 안전성 및 바이러스 예방·치료 효과 확인에 있음. 연구 내용은 분말화된 항바이러스 단백질을 닭에 투여해 체중 변화, 회복, 생존률, qRTPCR 기반 바이러스 역가 감소, 폐 조직 H&E staining/표현형 변화 분석을 수행함. 장기 투여 안정성은 체내 ALT/AST 및 제형안정성(검출 유지 기간) 비교로 판단함. 또한 약 30 kDa, 직경 3.5 nm 단백질을 초음파 가습기·고압분사기·가루분사기 에어로졸로 점막전달 조건을 확립하고 증상·치사율·바이러스 역가로 예방효과 평가함. 기대 효과는 긍정적 결과 시 외부공동연구팀과 사업화 추진과 바이오 소재 기반 항바이러스 물질 개발 과정의 체계화로 생명공학·의학 연구 기초자료 제공에 있음.