장관암(Intestinal cancer)은 미국에서 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인으로, 2025년에는 52,900명의 사망자가 발생할 것으로 예상된다. 만성 염증은 발암 과정의 기여 요인으로 잘 알려져 있다. 염증성 장질환(inflammatory bowel disease)을 가진 환자는 암이 발생할 위험이 1.7배 증가한다. 염증을 유발하거나 완화하는 화합물을 규명하는 것은 암 예방과 치료에 있어 중요하다. 오가노이드는 특정 장기의 시험관 내 3차원(in vitro 3D) 세포 배양 모사체로서, 전통적인 2차원(2D) 세포 배양이나 동물 모델에 비해 약물 효능 및 독성 평가를 위한 보다 생리학적으로 관련성 높고 신뢰할 수 있는 사람 기반 모델을 제공한다. 본 연구는 다양한 염증성 및 항염증성 작용제의 효과를 스크리닝하고 모니터링하기 위해 생물발광(bioluminescent) 장 염증 리포터 오가노이드의 개발과 적용에 초점을 둔다. 유도만능줄기세포(iPSC) 또는 환자 유래 조직으로부터 얻은 건강한 장 오가노이드를 NF-kB nanoLuc® 리포터 플라스미드로 형질감염(transduced)하여, 발광 기반으로 NF-kB 활성의 변화를 모니터링할 수 있게 하였다. 우리는 각각 안정적이며 분석에 바로 투입 가능한 NF-kB 리포터 오가노이드를 만들기 위해 렌티바이러스(LV)와 아데노-관련 바이러스(AAV) 전달 시스템을 사용하였다. 형질감염이 성공적으로 이루어진 오가노이드는 서로 다른 염증성 및 항염증성 화합물의 영향을 평가하기 위해 3차원(3D) 및 2.5차원(2.5D) 포맷 모두에서 분석하였다. NF-kB의 활성화를 측정하기 위해, 인산화된 p65(p-p65) 수준을 검출하기 위한 Lumit® 면역분석법(immunoassay)을 사용하였다. 여러 분비성 및 세포내 사이토카인과 케모카인의 단백질 및 mRNA 수준은 면역분석과 RT-qPCR을 통해 정량하였다. 안정적 NF-kB NanoLuc 리포터 오가노이드는 감염다중도(multiplicity of infection) 1000에서 LV 형질감염을 수행한 뒤 퓨로마이신(puromycin) 선택을 거쳐 확립하였다. 또한 AAV 혈청형 3을 이용하여 일시적(transient), 분석에 바로 투입 가능한 리포터 오가노이드를 생성하였다. 분석한 사이토카인들 중에서는 TNFα, IL-1β, 및 플라겔린(flagellin) 혼합물(cocktail) 처리 후 3시간 및 6시간 시점에서 가장 높은 리포터 활성(reporter activity)이 관찰되었다. 세포내 인산화 phospho-p65 수준의 증가는 관찰된 리포터 활성과 상관관계를 보였다. 나아가 NF-kB 활성화는 CXCL8, IL-1β, TNFα를 포함한 다른 여러 세포내 및 분비성 사이토카인의 유의한 상향 조절을 유도하였다. 특히, 토파시티닙(Tofacitinib)과 같은 확립된 항염증성 작용제 처리 시 상승된 리포터 활성과 하위 사이토카인 수준이 감소하였다. 결론적으로, 최적화된 프로토콜을 통해 개발한 생물발광 장 NF-kB 리포터 오가노이드는 잠재적 약물 후보의 염증성 효과를 효과적으로 모니터링하기 위한 고처리량(high-throughput) 플랫폼을 제공한다.

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