활성화된 단일뉴클레오타이드에 의한 비효소적 RNA 프라이머 연장은 선사시대 RNA 복사를 연구하는 모형으로 오랫동안 활용되어 왔다. 우리는 최근, 프라이머 연장 속도가 유입되는 단량체와 그로부터 하류에 있는 두 번째 활성화 단량체 사이에서 형성되는 이미다졸리움-브리지 결합 디뉴클레오타이드에 의해 크게 향상됨을 보였다. 그러나 하류 단량체를 활성화 올리고뉴클레오타이드로 대체하면 프라이머 연장 속도는 더 한층 증가한다. 심지어 활성화되지 않은 하류 올리고뉴클레오타이드도 활성화 단량체 하나와 프라이머의 반응 속도를 다소 향상시킨다. 본 연구에서는 최근 합성된 비가수분해성 기질 유사체인 구아노신 5'-(4-메틸이미다졸릴)-포스포네이트(guanosine 5'-(4-methylimidazolyl)-phosphonate, ICG)를 이용한 RNA 복합체의 결정학적 연구를 통해 이러한 효과들의 기작을 규명한다. ICG는 비효소적 프라이머 연장 실험에서 흔히 사용되는 기질인 2-메틸이미다졸 활성화 구아노신-5'-인산(2-MeImpG)을 모방한다. 우리는 프라이머-주형 복합체에서 하류로 결합된 ICG 잔기가 하나 또는 두 개인 경우에 대해, 프라이머-주형 복합체의 결정 구조를 제시한다. 두 경우 모두, 프라이머 인접부에 있는 ICG의 아릴-포스포네이트 작용기는 무질서(disordered) 상태이다. 하류 올리고뉴클레오타이드의 영향을 조사하기 위해, 5'-ICG 잔기, 5'-인산 또는 5'-하이드록실 중 하나를 갖는 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드를 전사하였다. 이어서, 각 세 종류의 하류 올리고뉴클레오타이드 사이에 낀 결합된 ICG 단량체를 포함하는 프라이머-주형 복합체의 결정 구조를 결정하였다. 놀랍게도, 세 올리고뉴클레오타이드 모두 ICG 단량체의 입체구조를 경직화시키고, 이를 프라이머 3'-하이드록실에 의한 공격에 적합한 위치에 배치한다. 또한, 이미다졸리움-브리지 중간체의 유사체인 GpppG를 상류 프라이머와 하류 보조 올리고뉴클레오타이드 사이에 끼워 넣거나, 하류 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 공유결합으로 연결한 경우, 해당 복합체는 하류 올리고뉴클레오타이드가 없는 경우보다 프라이머 연장을 위한 사전 배향(preorganization)이 더 잘 이루어진다. 본 결과는 하류 보조 올리고뉴클레오타이드가 프라이머-주형-중간체 복합체의 반응성 있는 구조를 유리하게 형성함으로써 프라이머 연장의 촉매에 기여한다는 점을 시사한다.

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