친애하는 편집자님, 핵인자 카파-Β 수용체 활성화 인자(ligand) (RANKL)의 새로운 수용체로서, 류신-풍부 반복 함유 G-단백질 결합 수용체 4 (LGR4)가 최근 도입되었다. RANKL–RANK 신호전달과 달리, RANKL–LGR4는 NFATc1의 핵 내 이동(translocation)을 억제하여 파골세포 활성을 억제한다.1-3 또한, 중요한 RANKL–RANK 결합 부위에서 부위-지정 돌연변이(site-directed mutations)를 통해 새로운 돌연변이 RANKL이 도입되었다. 이 돌연변이 RANKL은 RANK를 회피하고 LGR4에 결합함으로써 파골세포 생성(osteoclastogenesis)을 억제한다.4-6 그러나 RANKL과 유사한 구조를 갖는 경우, 골보호소프린(osteoprotegerin, OPG)에 의해 포획(scavenging)되는 방식에 취약점이 있다.7 OPG는 RANKL을 제거하는 효과적인 물질이므로, 돌연변이 RANKL 역시 포획될 수 있다.8 따라서, OPG에 대한 친화성 없이 LGR4 신호전달을 유발하여 파골세포 활성을 억제하는 고도화된 RANKL 돌연변이를 수행하였고, 골다공증에 대한 치료제로서의 적용 가능성을 조사하였다. 이전 돌연변이 RANKL(001)은 K180R, D189I, R190K, H223F 및 H224Y에서의 변환(transformants)을 포함하였으며, OPG에 대한 저친화성(low affinity)을 위해 011의 Q236D 변환 또는 012의 F269L 변환, 013의 F269Y 변환, 014의 F269H 변환을 포함하는 고도화 돌연변이 RANKL이 생성되었다(011 및 013에 대해 011과 012에 각각 변환이 포함됨). 이들은 야생형(wild type, WT) RANKL(WT)에서의 OPG 친화성과 비교하여 제시되었고(그림 1A 및 그림 S1), OPG 및 RANK에 대한 결합 친화성이 가장 낮은 후보를 확인하기 위해, 마이크로스케일 열영동(microscale thermophoresis, MST)을 이용하여 RANK 또는 OPG와 각 돌연변이 RANKL 후보 간 결합을 WT RANKL과 비교하였다(그림 1B,C; 그림 S2 및 S3). 011과 013의 OPG에 대한 결합 친화성은 나타나지 않았다. RANK와 011/013 간 결합 친화성은 약 17.1 µM였으며, LGR4와 013의 결합 친화성은 가장 높았는데(약 8.59 µM; 그림 S4), 이러한 결과는 013이 잠재적 후보임을 시사하였다. 어떤 돌연변이 RANKL이 파골세포의 분화 및 활성에 가장 큰 억제 효과를 갖는지 확인하기 위해, 파골세포 분화 및 활성을 나타내는 타르트레이트-저항성 산성 포스파타제(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)를 염색하고 돌연변이 RANKL 후보 또는 OPG 처리군에서의 골 흡수(resorbing pits)를 분석하였으며, WT 처리 하에서 골수유래 대식세포(bone marrow-derived macrophage, BMM)들을 배양하였다. 그 결과 013은 TRAP 양성 BMM에 대해 가장 강한 억제 효과를 보였고(그림 1D,E), TRAP 양성 BMM의 수는 013에서 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(그림 1F,G). 또한 013은 WT 처리 BMM에서 골 흡수 소와 골 흡수 pit의 면적을 감소시켰다(그림 1H,I). 따라서 013은 파골세포에 대해 억제 역할을 하며 잠재적인 고도화 돌연변이 RANKL일 수 있다. 고도화 돌연변이 RANKL이 RANK 또는 LGR4 신호전달 연쇄에 미치는 영향을 조사하기 위해, 013만 처리한 BMM에서 TRAP 염색을 수행하였다. WT와 비교하여, 013은 400 ng/mL로 처리한 이후에도 TRAP 양성 BMM을 유도하지 못하였다(그림 2A,B). 013+WT군에서는 WT에 비해 TRAP, NFATc1 및 OSCAR(파골세포 분화 및 활성의 표지자) mRNA 발현이 현저히 감소하였다(그림 2C). 또한 WT RANKL 존재 하에서, 013 처리 또는 OPG 처리 BMM에서는 핵 내 NFATc1이 검출되지 않았다(그림 2D,E). 더 나아가, WT 또는 013 처리 BMM에서 RANK 및 LGR4 신호전달 경로와 연관된 AKT 및 GSK-3β 인산화를 평가하였다(그림 2F,G). AKT 인산화는 시간 의존적 양상에서 WT와 013 간 유의한 차이를 보였으나, GSK-3β 인산화에서는 WT와 013 사이에 차이가 관찰되지 않았다. 파골세포 생성(osteoclastogenesis) 과정에서, 고도화 돌연변이 RANKL 후보 013이 RANKL-유도 LGR4 신호전달 연쇄에 미치는 영향을 규명하기 위해, CRISPR/Cas9 방법을 사용하여 RAW 264.7(RAW264.7/LGR4 CKO)에서 LGR4 조건부 결손을 수행하였다(그림 S5 및 S6). WT 존재 하에서, RAW264.7/LGR4 CKO의 TRAP 양성 면적은 RAW264.7의 것보다 증가하였다(그림 2H,I). RAW264.7에서, OPG는 WT 존재 하에 AKT 인산화 감소를 유도하고 GSK-3β를 증가시켰다(그림 2J,K). 또한 013은 OPG 유무와 상관없이 RAW264.7에서 GSK-3β를 약간 증가시켰다(그림 2L). RAW264.7/LGR4 CKO에서 013 처리군과 013+OPG 처리군 간 GSK-3β에는 유의한 차이가 없었다. 따라서 고도화 돌연변이 RANKL은 파골세포 전구세포에서 OPG의 존재 여부와 관계없이 LGR4 의존적 GSK-3β 신호전달을 유발할 수 있다. 골 흡수(bone resorption)에 대한 영향을 확인하기 위해, WT와 013을 마우스에 투여하였다(그림 3A). WT+013군의 해면골(trabecular bone)은 WT군보다 현저히 더 두껍고 치밀했으며(그림 3B,C), BV/TV, BV 및 BMD 지표가 개선되었다. 피질골(cortical bone)의 경우 Ct.Th.와 Ct.Ar는 군 간 차이가 없었다(그림 3D). 또한 WT 또는 013을 접종한 마우스에서 GST-RANKL과 LGR4가 동시에 검출되었으나(그림 3E,F), GST-RANKL과 RANK의 공위치화(colocalization)는 WT 유도 마우스에서만 관찰되었다. 따라서 고도화 돌연변이 RANKL은 LGR4 자극을 통해 골 흡수를 유의하게 회복시키고 해면골의 골 흡수를 억제하였다. 골 흡수에 대한 치료 효과를 입증하기 위해, OVX 마우스에 013 또는 OPG를 접종하였다(그림 4A). 원위 대퇴골(distal femur)의 해면골 구조는 OVX+013군이 무처치 OVX군보다 현저히 높게 나타났다(그림 4B). 아울러 BV/TV 및 BMD는 OVX 마우스에서 감소하였고, 013 처리로 인해 OPG군과 유사하게 회복되었다(그림 4C,D). H&E 및 TRAP 염색을 이용한 조직학적 분석과 CTSK에 대한 면역조직화학적 분석 결과, OVX 마우스에서는 해면골 세포들 사이의 간질 공간이 확장되어 있었다(그림 4E). 그러나 OVX+013군의 해면골은 정상적인 배열 양상을 갖춘 두껍고 치밀한 네트워크를 보였고, 간질 공간은 최소화되어 OPG군과 유사하였다. CTSK에 대한 면역조직화학적 분석과 TRAP 염색 결과, OVX 마우스는 대조군 마우스보다 CTSK- 및 TRAP-양성 파골세포가 더 많았으나, 013 처리된 OVX 마우스는 OVX 마우스보다 CTSK- 및 TRAP-양성 파골세포 수가 더 적었다(그림 4F,G). 따라서 고도화 돌연변이 RANKL 013은 OVX 유발 골 흡수를 억제할 수 있다. 본 연구에는 몇 가지 한계가 있다. 첫째, 골 항상성(bone homeostasis)의 균형을 위한 RANK 신호전달 연쇄 또는 골형성(bone formation)의 영향에 대해서는 제한된 검증만 존재한다. 둘째, 마우스 모델에서 장기간 처리의 효과는 추가적인 중개 연구를 위해 필요할 수 있다. 보완 자료(Supporting Information). 마지막으로, RANK 결합 부위에서 5점 돌연변이(K180R, D189I, R190K, H223F 및 H224Y)를 포함하고 OPG 결합에 영향을 주는 1점 돌연변이(F269Y)를 포함하는 고도화 돌연변이 RANKL 013은 외인성 OPG에 의해 방해받지 않으면서 LGR4 신호 자극을 통해 파골세포 활성화를 억제하는 것으로 보인다(그림 4H). 따라서 고도화 돌연변이 RANKL의 개발은 골다공증에 대한 혁신적인 치료 전략이 될 수 있다. Yuria Jang, Yongjin Cho, Youngjong Ko, Yeonhee Moon, Chang-Moon Lee, Wonbong Lim은 연구를 설계하고 수행했으며, 데이터를 분석하고 해석한 뒤 논문을 작성하였다. Yuria Jang과 Yongjin Cho는 Wonbong Lim의 감독 하에 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 연구를 수행하였다. Chang-Moon Lee는 Micro-CT 분석을 수행하고 일부 그림에 기여하였다. Yeonhee Moon은 시료에 대한 병리학적 검토를 수행하였다. Wonbong Lim은 공개적으로 이용 가능한 데이터 세트를 분석하고 연구를 감독하였다. 저자들은 보고할 사항이 없다고 진술한다. 저자들은 이해상충이 없다고 선언한다. 본 연구는 한국연구재단(National Research Foundation of Korea, NRF)의 지원을 받았으며, 한국 정부의 연구비 지원을 받아 수행되었다(NRF-2021R1A6A3A13046475, NRF-2022R1A2C2009119, NRF-2021R1I1A3046499 및 RS-2023-00217471). 모든 동물 실험은 조선대학교(광주, 대한민국) 생명윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인 번호 CIACUC2022‑S0008에 따라 기관 및 정부의 요구사항을 준수하여 수행되었다. 원자료 및 분석 자료, 그리고 물질에 대한 모든 요청은 해당 요청이 대한민국 조선대학교 및 해당 저자에 의해 지식재산 또는 비밀유지 의무의 적용 대상에 해당하는지를 확인하기 위해 즉시 검토된다. 참고로, 출판사는 저자들이 제공한 보완 정보의 내용 또는 기능에 대해 책임지지 않는다. 누락된 내용 이외의 문의 사항은 논문의 해당 저자에게 문의해야 한다.

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