패혈증 쇼크 환자에서 비타민 C에 대한 여러 건의 무작위 대조군 연구가 시행되었으나 유의한 사망률 감소를 가져오지 못했다. 하지만 이러한 연구들은 사망률의 차이를 평가하기에는 검정력이 부족했고 비타민 C 사용을 최대 4일로 제한했다. 본 연구자는 cecal ligation and puncture(CLP)에 의한 패혈증 마우스 모델에서 예비 연구를 시행하였고...
비타민 C
패혈증
패혈증 쇼크
사망률
2
주관|
2022년 5월-2025년 2월
|56,433,000원
패혈증 쇼크에서 비타민 C 연장 치료의 유용성: 전임상 및 임상 연구
1차년도 - 2차년도에는 복막염에 의한 패혈증을 유도하고 비타민 C 장/단기 투여를 비교한다. C57BL/6J 마우스(F, 18-20 wk)를 이용하여 CLP를 유도하여 마우스 복강 내 feces에 의한 염증을 유발하고 비타민 C 장기(8일) 투여군과 단기(4일) 투여군으로 무작위 배정하여 각각 비타민 C를 적용하고, 대조군으로 비타민 C를 적용하지 않는 군을 함께 관찰한다. 패혈증 모델 유도 후 급성 모델로 만 8일에 희생하여 혈액과 장기를 얻어 생화학적 분석을 시행하며, 만성 모델로는 만 28일에 희생하여 혈액과 장기로부터 생화학적 분석을 시행한다. 혈액을 통한 생화학적 분석은 염증성 사이토카인 2종(IL-6, TNF-α)과 항염증성 사이토카인 2종(IL-10, IL-1Ra)에 대한 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 실험법으로 수행하고, 조직에 대한 분석은 간의 조직을 얻어 neutrophil elastase 발현 양상 및 염증성 단백질 및 전사인자의 발현을 비교 분석한다. 2차년도 - 3차년도에는 무작위 대조군 연구를 통해 비타민 C 5일 이상 투여와 4일 이내 투여를 비교한다. IRB 승인 후 본원 내과 중환자실에 입원한 만 19세 이상의 환자 중 패혈증에 해당하고 등록기준을 만족시키는 경우를 동의서 취득 후 연구 대상에 포함한다. 최대 96시간 동안(4일 이내 군) 또는 사망/중환자실 퇴실할 때까지(5일 이상 군) 6 g/day의 비타민 C를 정맥으로 투여받도록 무작위(1:1) 배정한다. 1차 평가변수는 정맥 내 승압제 요구량(용량 및 기간)이고, 2차 평가변수는 Sequential Organ Failure Assessment 점수 변화, 중환자실 재원일 수 및 사망률이다. 혈액 샘플은 패혈증 진단 후 1-2일, 3-4일 및 6-8일에 총 3회 수집한다. 상업적 ELISA 키트를 사용하여 IL-6, TNF-α 및 IL-10의 정량을 측정한다. 패혈증 시 면역 부전의 대리 표지자로 제시되는 단핵구 HLA-DR의 정량화도 시행한다. 비타민 C 5일 이상 군과 4일 이내 군 간 시점에 따른 IL-6, TNF-α, IL-10, IL-10/TNF-α 비 및 HLA-DR의 변화를 확인한다.
1차년도에는 패혈성 쇼크 환자를 대상으로 전향적 코호트를 구성하였다. 본원 IRB 승인 후 패혈증으로 본원 내과 중환자실에 입원한 만 19세 이상의 환자 중 패혈성 쇼크에 해당되고 비타민 C 프로토콜을 투여 받은 경우를 전향적 코호트에 포함시켰다. 2차년도에는 전향적 코호트를 유지하면서 proinflammatory 및 anti-inflammatory 사이토카인을 측정한다. 혈액 샘플은 각 환자에서 패혈증 진단 후 1–2일(시점 A), 3–4일(시점 B) 및 6–8일(시점 C)에 총 3회 수집한다. 상업적 ELISA 키트(Human Luminex Performance Assay; R&D Systems)를 사용하여 혈액에서 IL-6, TNF-α 및 IL-10의 정량을 측정한다. 생존자와 사망자 간 시점 A–C에 따른 혈중 IL-6, TNF-α, IL-10 및 IL-10/TNF-α 비의 변화를 확인한다. 또한, 패혈증 관련 사망에 대한 고용량 비타민 C의 효과 분석을 위해 국민건강보험공단 자료를 이용하여 국내에서 패혈증 진단받고 중환자실 입실한 환자 중 비타민 C를 투여 받은 환자와 투여 받지 않은 환자 간 outcome을 비교한다. 3차년도에는 전향적 코호트를 유지하면서 단핵구 HLA-DR의 정량화를 시도한다. 비타민 C 프로토콜과 같은 면역 증강 요법은 mHLA-DR 발현이 감소되는 면역억제 단계에서 적용해야 효과가 있을 수 있다. 단핵구 HLA-DR의 정량화는 기존에 알려진 절차에 의해 시행한다. 간단히 말하자면, 전혈을 BD Quantibrite Anti-HLA-DR/Anti-Monocyte Stain(Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 배양한 후 RBC Lysis Buffer(Biolegend, San Diego, CA)를 사용하여 용해시킨 다음 2% 파라포름알데하이드에 고정한다. 샘플은 5색 업그레이드(CyTech, Fremont, CA)를 사용하여 FACScan(Becton Dickinson, San Jose, CA)에서 획득한다. 플로우 파일은 CellQuest Pro(Becton Dickinson, San Jose, CA)에서 수집하고 분석한다. 세포 당 결합된 항체(Antibodies bound per cell, ABC)는 단핵구의 HLA-DR 기하 평균 형광 강도(geometric mean fluorescence intensity, GMFI)를 BD Quantibrite-phycoerythrin(PE) beads(Becton Dickinson, San Jose, CA)에 표준화하여 계산한다. 다른 사이토카인과 마찬가지로 패혈증 진단 후 총 3회 혈액 샘플을 수집한다. 생존자와 사망자 간 시점 A–C에 따른 HLA-DR의 변화를 확인한다.
1차년도에는 패혈성 쇼크 환자를 대상으로 전향적 코호트를 구성한다. 본원 IRB 승인 후 패혈증으로 본원 내과 중환자실에 입원한 만 19세 이상의 환자 중 패혈성 쇼크에 해당되고 비타민 C 프로토콜을 투여 받은 경우를 전향적 코호트에 포함한다. 전체 코호트를 중환자실 생존자와 사망자로 나누어 두 그룹 간 기저 특성을 비교한다. 다음, 전체 코호트를 VITASEP 점수에 의해 분류한 후 점수에 따른 기저 특성 및 사망률의 차이를 재확인한다(internal validation). 2차년도에는 전향적 코호트를 유지하면서 proinflammatory 및 anti-inflammatory 사이토카인을 측정한다. 혈액 샘플은 각 환자에서 패혈증 진단 후 1–2일(시점 A), 3–4일(시점 B) 및 6–8일(시점 C)에 총 3회 수집한다. 상업적 ELISA 키트(Human Luminex Performance Assay; R&D Systems)를 사용하여 혈액에서 IL-6, TNF-α 및 IL-10의 정량을 측정한다. 생존자와 사망자 간 시점 A–C에 따른 혈중 IL-6, TNF-α, IL-10 및 IL-10/TNF-α 비의 변화를 확인한다. 본 연구자는 선행연구를 통해 비타민 C 프로토콜 전 환자 특성에 따라 중환자실 사망을 예측하는 VITASEP 점수를 개발하였고 VITASEP 점수가 낮은, 즉 체온이 높고 백혈구와 C-반응성 단백질 수치가 높은 과염증 하위 표현형을 확인하였다. 전체 코호트를 VITASEP 점수에 의해 분류한 후 그룹 간 시점 A–C에 따른 혈중 IL-6, TNF-α, IL-10 및 IL-10/TNF-α 비의 변화를 확인한다. 3차년도에는 전향적 코호트를 유지하면서 단핵구 HLA-DR의 정량화를 시도한다. 비타민 C 프로토콜과 같은 면역 증강 요법은 mHLA-DR 발현이 감소되는 면역억제 단계에서 적용해야 효과가 있을 수 있다. 단핵구 HLA-DR의 정량화는 기존에 알려진 절차에 의해 시행한다. 간단히 말하자면, 전혈을 BD Quantibrite Anti-HLA-DR/Anti-Monocyte Stain(Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 배양한 후 RBC Lysis Buffer(Biolegend, San Diego, CA)를 사용하여 용해시킨 다음 2% 파라포름알데하이드에 고정한다. 샘플은 5색 업그레이드(CyTech, Fremont, CA)를 사용하여 FACScan(Becton Dickinson, San Jose, CA)에서 획득한다. 플로우 파일은 CellQuest Pro(Becton Dickinson, San Jose, CA)에서 수집하고 분석한다. 세포 당 결합된 항체(Antibodies bound per cell, ABC)는 단핵구의 HLA-DR 기하 평균 형광 강도(geometric mean fluorescence intensity, GMFI)를 BD Quantibrite-phycoerythrin(PE) beads(Becton Dickinson, San Jose, CA)에 표준화하여 계산한다. 다른 사이토카인과 마찬가지로 패혈증 진단 후 총 3회 혈액 샘플을 수집한다. 생존자와 사망자 간 시점 A–C에 따른 HLA-DR의 변화를 확인하고 VITASEP 점수에 따른 HLA-DR의 변화를 확인한다.
