본 연구는 파킨슨병에서 도파민세포 감소를 억제하는 침 치료 신경보호효과와 관련된 유전자를 찾아, 식물에서 치료 후보 물질을 생산하고 동물에서 효능을 검증하는 전략임. 연구목표는 도파민세포 감소 억제 후보 유전자를 선별해 애기장대 또는 순간발현 담배에서 과발현 생산 후, 파킨슨병 동물모델에서 신경보호효과와 작용기전을 확인해 파킨슨병 조절 후보 물질을 도출하는 데 있음. microarray 기반 screening과 SH-SY5Y·L6에서 siRNA knock-down 후 western blot, real-time PCR로 기전 탐색, CaMV35S 기반 pGWB8/pGWB22 벡터 및 His/GST tag 정제(Nickel/Glutathione column) 수행, MPTP 20mg/kg/day 마우스에서 TH·DAT·alpha-synuclein 면역염색/웨스턴블롯으로 검증함. 기대효과는 치료효과 향상과 새로운 치료 기전/target 제시 및 예방 근거 마련으로 의료비 절감 기여 가능성임.

본 과제는 파킨슨병의 핵심 원인인 α-synuclein 과다침착을 조절하는 침 치료의 신경보호 효과 기전을 규명하는 연구임. 연구 목표는 생물정보학과 실험생물학을 병용해 유전자 수준에서 침의 α-synuclein 조절 메커니즘을 세계 최초로 밝히고 치료법·예방법 마련 근거를 확보하는 데 있음. 연구 내용은 microarray screening 후 siRNA knock-down과 western blot, real-time PCR로 관련 유전자 기능을 확인하고, pcDNA3-Myc/His 과발현 및 G418 stable cell line 구축 후 MPP+ 처리에서 alpha-synuclein 발현·세포사멸과 siRNA 연관성 분석 수행함. in vivo에서는 MPTP군 대조 및 침치료군에서 Striatum(ST), Substantia Nigra(SN) 조직의 western blot, Immunohistochemistry로 기전을 검증하며 knock-out mouse로 심화함. 기대 효과는 침 치료 타깃 유전자 최초 규명, 후보약물 개발 target 활용, 예방차원의 침 치료 가능성과 파킨슨병 의료비 절감 근거 마련임.

본 과제는 파킨슨병에서 α-synuclein이 과다 축적되는 현상을 침 치료로 조절하는 방법을 밝히는 연구임. 침이 어떤 유전자를 통해 신경을 보호하는지 기전 규명을 목표로 함. 연구 목표는 α-synuclein 조절을 통한 침의 신경보호효과를 생물정보학과 실험생물학으로 유전자 수준에서 세계 최초로 규명하고 치료법·예방법 마련 근거 확보에 있음. 연구 내용은 microarray screening으로 알파-시누클레인 관련 유전자를 발굴하고 siRNA knock-down, 후보유전자 과발현 세포주에서 MPP+ 처리 후 발현·병증화 및 세포사멸을 확인하며 immunoprecipitation 후 MALDI-TOF로 interaction 단백질을 탐색함. 또한 MPTP 동물모델에서 western blot, Immunohistochemistry로 작용 기전을 검증하고 유전자 knock-out mouse 제작으로 in vivo 기능을 심화함. 기대 효과는 침의 효능 입증, 알파-시누클레인 축적 억제 기반 후보약물 target 제시, 예방차원의 침 치료 근거 마련 및 의료비 절감에 있음.

1. 신경독소인 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine (MPTP)를 이용하여 파킨슨병 동물 모델의 제작 및 침자극 (태충 및 양릉천 경혈지점)실시 ？ 4 그룹의 실험군: 대조군, MPTP 처리군, MPTP 처리 및 태충, 양릉천 침처치군, MPTP 처리 및 비경혈부위 침처치군 ？ MPTP로 유도된 병증 마우스 모델에서 태충 및 양릉천 침자극 후 효과 확인 ？ 각 조직에서 Western blot과 Immunohistochemistry를 이용하여 파킨슨병 동물모델이 잘 만들어 졌는지 확인 ？ 알파-시누클레인의 축적양상을 각 조직별로 검증하고 알파-시누클레인의 축적을 억제하는 침의 효과 확인 2. MPTP 파킨슨병 동물모델에서 알파-시누클레인의 축적에 영향을 미치는 침의 치료효과 확인과 생물정보학 및 실험생물학적 기법을 이용한 메커니즘 규명 ？ Total RNA를 추출 및 cDNA 제작, Whole-Transcripts Genearray 실시 ？ Affymetrix사(USA)의 Genearray Mouse Gene 1.0 ST array에 hybridization시킴 ？ GeneChip？ Operating Software (USA)로 제어되는 Fluidics와 Scanning-GeneChip？ Scanner를 이용해서 DAT file과 CEL file 자료를 확보함 3. GenePlex software를 이용한 유전자 발현 양상 비교 분석 ？ Expression Console software에서 CEL file을 이용하여 RMA 방법 또는 PLIER 방법으로 데이터 chip file을 생성함 ？ Data analysis-DEG (Differentially Expressed Gene) finding module, Clustering analysis module과 Pathway analysis module을 이용하여 분석함 (GenPlex v3.0 ISTECH, Korea) ？ 각 그룹간의 유전자 발현 양상 분석 및 Quantitative Real-Time PCR을 이용한 검증 4. 알파-시누클레인의 축적을 억제하는 침 치료 작용과 관련된 유전자를 대상으로 과발현 세포주 확립 및 세포사멸 조사 ？ Microarray를 통해 도출된 유전자를 LN18 glioblastoma cell에 transformation 하고 하루 지나서 세포배양액을 교환함. G418을 처리하여 싱글 클로니가 될 때까지 selection을 진행함. 선택된 과발현 세포주를 western blot으로 확인을 하고 세포를 증식 시킴 ？ 과발현된 세포주에 MPP+를 농도 및 시간에 따라 처리한 후 Annexin V/ PI 와 FA