본 연구에서는 뇌내출혈로 인한 급성철분과부하가 신경퇴행성질환의 발병 또는 악화에 미치는 장기적인 영향을 파악하고 그 치료 방안을 모색하고자 한다. 이를 위하여 (1) 뇌내출혈이 신경퇴행성질환의 발병에 미치는 영향을 파악하고 (2) 뇌내출혈 후 철분 킬레이트제의 투여에 의한 치료 효과를 탐색한다.

(1) pDC의 형태적 특성 연구 (재도약연구, 2020 수행 중) 20개월 C57BL/6J 단일성별(암컷) Adhesion molecule의 발현 확인: 예비실험에서 확인한 ICAM, PECAM-1, vimentin 외에도 VCAM, VE cadherin에 대한 항체로 염색하여 발현 여부 추가 확인, TLO 내 면역세포의 분포와 pDC의 위치관계 파악, TUNEL, PCNA 염색을 통해 TLO 내에서 pDC의 apoptosis, proliferation 여부 확인 SEM을 이용한 세포의 형태 관찰: 콩팥과 간의 vibratome section을 pDC marker, CD45(immune cell marker)로 염색 후 CLEM을 이용하여 각 세포의 표면을 SEM으로 관찰, pDC의 가지돌기 발달 여부에 따라 TLO내 pDC의 활성화 여부를 확인 ImmunoEM을 이용한 adhesion molecule의 세포 내 발현 위치 확인: 콩팥과 간의 vibratome section을 VCAM, ICAM, PECAM-1, vimentin 등의 adhesion molecule에 대한 항체로 염색하여 세포 내 발현 위치 확인 (2) pDC의 기능적 특성 연구 (1차년도) 노화동물의 콩팥과 간에서 TLO를 분리, pDC marker로 염색하여 FACS로 pDC 분리, 배양 배양된 pDC를 IL-3 혹은 CD40L 처리하여 활성화 활성화 전, 후 세포군의 TEM, SEM을 이용한 형태 관찰 활성화 전, 후 세포군의 western blot을 통한 adhesion molecule 변화 확인 배양된 pDC를 이용한 transwell migration assay를 통하여 면역세포가 pDC에 의하여 이동하는지 관찰 pDC cell line과 pDC culture media를 microarray로 분석하여 면역세포 이동을 일으키는 특이적 변화물질 발굴 (3) 질병모델에서의 pDC 연구 (2,3차년도) NZBWF1/J mouse(SLE 동물모델)를 이용: 콩팥과 간의 면역세포 침윤 및 형태 변화 관찰, pDC의 형태적, 기능적 변화 연구 SLE 모델에서 antibody-mediate pDC depletion을 통한 치료 효과 관찰: Bst-2 antibody를 이용하여 일시적인 pDC의 depletion 후 혈액 내 염증수치, 콩팥과 간 내 면역세포 침윤 변화 관찰 1차 년도에 발굴한 변화물질의 활성을 조절하는 약물을 천연물 및 합성화합물에서 스크리닝하고 pDC 배양 세포에 처리하여 변화물질 및 adhesion molecule의 발현 변화를 ELISA 혹은 western blot으로 확인 위 in vitro assay에서 치료효과가 있는 후보군을 탐색하여 해당 물질을 SLE 모델에 투여 물질 투여에 의해 콩팥과 간 내 면역세포 침윤이 감소하는지 관찰 치료에 의한 전반적인 콩팥과 간의 형태적, 기능적 변화와 혈액 내 염증수치 변화 등의 치료효과 관찰

(1) pDC의 형태적 특성 연구 (재도약연구, 2020 수행 중) 20개월 C57BL/6J 단일성별(암컷) Adhesion molecule의 발현 확인: 예비실험에서 확인한 ICAM, PECAM-1, vimentin 외에도 VCAM, VE cadherin에 대한 항체로 염색하여 발현 여부 추가 확인, TLO 내 면역세포의 분포와 pDC의 위치관계 파악, TUNEL, PCNA 염색을 통해 TLO 내에서 pDC의 apoptosis, proliferation 여부 확인 SEM을 이용한 세포의 형태 관찰: 콩팥과 간의 vibratome section을 pDC marker, CD45(immune cell marker)로 염색 후 CLEM을 이용하여 각 세포의 표면을 SEM으로 관찰, pDC의 가지돌기 발달 여부에 따라 TLO내 pDC의 활성화 여부를 확인 ImmunoEM을 이용한 adhesion molecule의 세포 내 발현 위치 확인: 콩팥과 간의 vibratome section을 VCAM, ICAM, PECAM-1, vimentin 등의 adhesion molecule에 대한 항체로 염색하여 세포 내 발현 위치 확인 (2) pDC의 기능적 특성 연구 (1차년도) 노화동물의 콩팥과 간에서 TLO를 분리, pDC marker로 염색하여 FACS로 pDC 분리, 배양 배양된 pDC를 IL-3 혹은 CD40L 처리하여 활성화 활성화 전, 후 세포군의 TEM, SEM을 이용한 형태 관찰 활성화 전, 후 세포군의 western blot을 통한 adhesion molecule 변화 확인 배양된 pDC를 이용한 transwell migration assay를 통하여 면역세포가 pDC에 의하여 이동하는지 관찰 pDC cell line과 pDC culture media를 microarray로 분석하여 면역세포 이동을 일으키는 특이적 변화물질 발굴 (3) 질병모델에서의 pDC 연구 (2,3차년도) NZBWF1/J mouse(SLE 동물모델)를 이용: 콩팥과 간의 면역세포 침윤 및 형태 변화 관찰, pDC의 형태적, 기능적 변화 연구 SLE 모델에서 antibody-mediate pDC depletion을 통한 치료 효과 관찰: Bst-2 antibody를 이용하여 일시적인 pDC의 depletion 후 혈액 내 염증수치, 콩팥과 간 내 면역세포 침윤 변화 관찰 1차 년도에 발굴한 변화물질의 활성을 조절하는 약물을 천연물 및 합성화합물에서 스크리닝하고 pDC 배양 세포에 처리하여 변화물질 및 adhesion molecule의 발현 변화를 ELISA 혹은 western blot으로 확인 위 in vitro assay에서 치료효과가 있는 후보군을 탐색하여 해당 물질을 SLE 모델에 투여 물질 투여에 의해 콩팥과 간 내 면역세포 침윤이 감소하는지 관찰 치료에 의한 전반적인 콩팥과 간의 형태적, 기능적 변화와 혈액 내 염증수치 변화 등의 치료효과 관찰

1) pDC의 형태적 특성 연구 ● 예비실험 결과 C57BL/6J 콩팥에서 면역세포의 침윤(TLO formation)은 3개월 동물에서는 발견되지 않았고 15개월부터 육안적으로 확인되는 TLO가 발견되었으며 18개월 이후 현저하게 증가하였음. 이에 본 연구에서는 20개월 C57BL/6J를 사용 ● TLO formation은 성별에 따른 차이가 있어 단일성별(암컷)을 사용 예정 ● pDC marker는 예비실험에서 Bst-2를 사용하였으며 항체의 특이성 검증을 위해 immunoEM을 시행하여 염색된 세포의 형태가 기존 발표[3]된 pDC와 유사함을 확인하였음(그림5). ● Adhesion molecule의 발현 확인 - 예비실험에서 확인한 ICAM, PECAM-1, vimentin 외에도 VCAM, VE cadherin에 대한 항체로 염색하여 발현 여부 추가 확인 - Bst-2(pDC marker), CD45(immune cell marker)로 염색 후 TLO 내 면역세포의 분포와 pDC의 위치관계 파악 - TUNEL, PCNA 염색을 통해 TLO 내에서 pDC의 apoptosis, proliferation 여부 확인 ● SEM을 이용한 세포의 형태 관찰 - 콩팥의 vibratome section을 Bst-2(pDC marker), CD45(immune cell marker)로 염색 후 Correlative Light and Electron Microscopy(CLEM)를 이용하여 각 세포의 표면을 SEM으로 관찰 - pDC의 가지돌기 발달 여부에 따라 TLO내 pDC의 활성화 여부를 확인 ● ImmunoEM을 이용한 adhesion molecule의 세포내 발현 위치 확인 - 콩팥의 vibratome section을 VCAM, ICAM, PECAM-1, vimentin 등의 adhesion molecule에 대한 항체로 염색하여 세포 내 adhesion molecule의 발현 위치 확인