□ 1차년도 연구목표 : 고분자 지지체/TGF-beta1 MSC/지지체 컴플렉스 확립 ○연구개발 내용 1 : 연골손상/골관절염 동물모델 확립 ○연구개발 내용 2 : TGF-beta1 발현 MSC 확립 -TGF-beta1은 이중 접합체 형태의 precursor로 만들어지며, 다단계의 프로세싱 과정을 거쳐 활성이 있는 mature form으로 만들어짐. 효율적인 생산을 위해 coding region을 활성이 높은 전사 촉진제 뒤에 삽입하며, 세포외로 분비를 촉진하기 위한 leader sequence를 삽입하여 발현 플라스미드를제조함. ○연구개발 내용 3 : 초다공성 고분자 지지체 개발 -줄기세포의 크기를 고려하여 다공성 지지체의 기공도를 조절하여 관절강내 주사가 가능하면서도sphere의 내부에 줄기세포가 생착할 수 있을 정도로 충분한 기공도를 갖는 초다공성 고분자 지지체를 개발함. ○연구개발 내용 4 : TGF-beta1 MSC 연골재생 평가(in vitro) -토끼 연골의 primary cell culture를 와 TGF-beta1 MSC를 공배양하여 각각 2, 4주 후 연골형성의 바이오마커인 COL2A1, PRG4, PRELP, DCN, FMOD의 유전자 발현을 pcr을 이용하여 분석함. ○연구개발 내용 5 : ESC 연골분화 유도 및 특성평가 - 배아줄기세포를 2주간 3단계의 분화 단계를 거쳐 연골세포로 분화시킴. 각 분화 단계별로 발현되는 전사조절 유전자의 발현을 realtime PCR을 이용하여 정량함으로써 분화 효율을 측정할 예정임. □ 2차년도 연구목표 : TGF-beta1/사멸제어 스위치 시스템 확립 ○연구개발 내용 1 : TGF-beta1 MSC/지지체 컴플렉스 연골재생 평가(in vitro) -토끼 연골의 primary cell culture를 와 TGF-beta1 MSC/지지체 컴플렉스를 공배양하여 각각 2, 4주 후 연골형성의 바이오마커인 COL2A1, PRG4, PRELP, DCN, FMOD의유전자 발현을 pcr을 이용하여 분석함. ○연구개발 내용 2 : TGF-beta1 MSC/지지체 컴플렉스 연골재생 평가(in vivo) -확립된 연골손상 및 골관절염 실험동물 모델에 TGF-beta1 MSC/지지체 컴플렉스를 수술적 방법으로 결손부위에 grafting하고 4주, 8주 후에 X ray 와 microCT를 이용하여 평가하고 조직학적으로 분석을 시행하여 연골재생여부를 정량적으로 분석함. ○연구개발 내용 3 : TGF-beta1/사멸제어 스위치 탑재 MSC확립 -TGF-beta1/사멸제어 스위치 BAC DNA를 배아줄기세포에 도입 후 G418에 저항성을 갖는 클론을 선별함. HGPRT 유전자에 TGF-beta1/사멸제어 스위치가 삽입된 클론을 선별한 후 HAT media에 대한 감수성으로 검증함. ○연구개발 내용 4 : COL2A1 리포터 ESC 확립 및 분화/검증 ○연구개발 내용 5 : TGF-beta1/사멸제어 스위치 탑재 MSC 연골재생 평가(in vitro/in vivo) -In vitro TGF-beta1 방출거동 분석 및 연골형성 유전자 발현 분석 ○연구개발 내용 6 : COL2A1 리포터 ESC 연골재생 평가(in vitro) -In vitro TGF-beta1 방출거동 분석 및 연골형성 유전자 발현 분석 □ 3차년도 연구목표 : TGF-beta1/사멸제어 스위치 탑재 MSC/지지체 콤플렉스 연골재생 평가 ○연구개발 내용 1 : TGF-beta1/사멸제어 스위치 탑재 MSC/지지체 컴플렉스 연골재생 평가(in vitro) -In vitro TGF-beta1 방출거동 분석 및 In vitro 연골형성 유전자 발현 분석 ○연구개발 내용 2 : TGF-beta1/사멸제어 스위치 탑재 MSC 연골재생 평가(in vivo) -In vivo 연골재생 평가 및 Dual kill switch에 의한 in vivo 세포 사멸제어 평가 ○연구개발 내용 3 : 연골세포 특이적 miRNA-mRNA 네트워크 분석 ○연구개발 내용 4 : 연골세포 특이적 miRNA를 이용한 분화조절 연구