본 과제는 신경계에서 가장 풍부한 신경 전달물질인 glutamate가 뇌졸중 후 나타나는 염증 반응에서 면역세포이동을 유도하는 chemoattractant 역할과 extracellular traps (ETs)의 inducer 역할을 하는 것을 보이고, ETs 생성 조절을 통해 뇌 손상을 억제할 수 있는 방안을 강구함. 더 나아가 본 연구 결과를 활용하여...

1차 연도 (2021) 개발 목표 1 : 뇌졸중 후 HMGB1 혈장축적 과 NETosis 유도 (뇌조직/뇌혈관) 및 혈소판 활성화 기전 규명 • 연구의 배경: HMGB1은 대표적인 DAMP molecule로 뇌졸중 후 급격히 세포밖으로 유리되어 혈장(및 CSF)에 과량 축적됨 그동안 HMGB1 연구는 뇌조직내 parenchymal cell (neuron, microglia, astrocyte) 관련 연구에 집중하여 염증 유도/악화 조절 작용이 보고됨. 본과제에서는 뇌졸중 후 혈관내에 축적된 HMGB1의 혈관내피세포, 면역세포, 혈소판 활성화와 상호조절 작용을 주목하여 조사함. • 연구내용 및 범위: ① 뇌졸중 후 HMGB1의 혈장내 축적조사 ② 뇌혈관내 neutrophil 조기 활성화, 혈소판 활성화와 NETosis 유도: HMGB1 역할 및 분자기전 조사 ③ HMGB1-PAD4 상호조절을 통한 혈액응고인자 활성화 조사 ④ recurrent stroke 동물모델 (MCAO+photothrombosis): 다양한 조전에서 2차혈전생성 동물모델 제작 2차 연도 (2022) 개발 목표 2 : 뇌졸중 후 Intravascular/parenchymal NETosis 유도기전 및 중요성, 그리고 HMGB1 작용 규명 • 연구의 배경: HMGB1의 platelet, thrombosis 관련 기능은 다양한 질병상태의 개별적 보고가 있으나 본 과제를 통하여 2차 혈전생성과 연관하여 종합적 접근을 수행함. 2차혈전 형성 (Recurrent stroke) 동물모델은 현재 셑업하여 확보하고있으며 본 과제를 통하여 2차 경색의 형성부위, 크기, 조직병리 및 분자마커 등의 분석을 1차경색후 분비된 HMGB1과 연결하여 체계적으로 분석 예정임. • 연구 내용 및 범위 : ① neutrophil-microglia 상호작용의 염증악화 사이클에 HMGB1 역할 규명-reduced type HMGB1 역할 조사 ② 뇌혈관내 NETosis-혈소판 상호작용을 통한 thrombosis 유도: HMGB1 양방향 중심조절자 역할 규명 ③ Recurrent stroke 동물모델 분석: 2차 혈전생성 과정에서의 HMGB1 작용 기전 규명 3차 연도 (2023) 개발 목표 3 : 뇌졸중 후 혈관내 혈전형성 관련 세포 및 인자의 유도/활성화 관련 HMGB1 작용기전 규명 • 연구의 배경: 본 연구자는 뇌졸중 후 뇌혈관내에 NETs 성분 (free DNA, histone.)과 함께 피브리노겐, tissue factor (TF), TF inhbitor (TFPI) 등 혈액응고인자가 축적되며 뇌졸중 후 뇌혈관내에 축적된 HMGB1이 이들의 중요 조절인자로 작용하여 2차혈전 생성을 유도함을 조사하고자 함. • 연구 내용 및 범위 : ① Intravascular HMGB1 매개 혈전 형성인자 (fibrinogen, TF, TFPI, VWF) 발현 및 활성 조절 조사 ② NETosis-HMGB1-thrombosis 매개 2차 혈전 형성의 분자기전 규명: 리셉터 및 신호전달계 조사 ③ HMGB1-PAD4 조절의 역할: PAD4에 의한 HMGB1, 혈액응고인자 modification 역할 조사 ④ Recurrent stroke model분석: HMGB1 중요성 규명, PAD4 억제제 효과 조사 4차 연도 (2024) 개발 목표 4 : 노화뇌를 사용하여 뇌졸중 후 2차 손상에서의 HMGB1의 중요성 확인 및 제어 방안 규명 • 연구의 배경: 노화에 따른 HMGB1의 뇌조직 및 혈액내 축적과 2차손상 관련성을 통한 HMGB1 역할 확인 및 1차 뇌졸중 후 HMGB1 작용 각 단계의 조절을 통한 (양, 분비, 분비후 작용, protein binding 등) 뇌혈관내 2차 손상 제어 효과 조사함. • 연구 내용 및 범위 ① 노화쥐의 뇌혈관내 HMGB1 축적과 2차 손상유도 역할 규명 ② 노화에 따른 HMGB1 type (redox-type)-특이적 리셉터와 신호전달계 조절 조사-중요성 검증, 제어방안 강구 ③ 뇌졸중 후 2차 손상억제제 발굴: HMGB1 억제제 및 기확보 아스피린 변이체 효과 확인 및 신규제재 발굴

본 연구는 뇌졸중 후 증가하는 extracellular traps formation이 혈전생성을 통하여 뇌졸중 재발을 유발하는 기전을 밝히고 제어방안을 강구하는 것을 목표로 다음과 같은 연구를 진행함. 1. transient MCAO와 permanent MCAO 동물모델을 제작 (1년차) ① 뇌졸중 동물모델에서 occlusion 이후 시간에 따른 혈관 내 면역세포 분포 변화 ② 뇌졸중 동물모델의 occlusion 시간 차이에 기인한 중증도에 따른 혈관 내 면역세포 분포 변화 ③ 뇌졸중 후 시간과 중증도에 따른 혈중 DNA 및 extracellular traps의 구성물의 양적 변화 조사함 2. 뇌졸중 후 혈액 내 면역세포의 lysis 진행 기전과 혈전생성 모델 확립 (2년차) ① 뇌졸중 후 분리된 neutrophil 또는 macrophage에서 발현되는 cytoskeletal protein의 분해효소 조사 ② Extracellular trap 구성물을 활용한 혈전생성 모델 확립 ③ Ex vivo 혈전생성 모델 확립 ④ Neutrophil 또는 Macrophage를 활용하여 NETosis 또는 ETosis와 혈소판 상호작용을 통한 혈전생성 모델 확립 3. 뇌졸중 동물 모델과 혈전생성 모델에서 억제제 투여 통한 뇌졸중 재발 억제 기전 확립 (3년차) ① 뇌졸중 동물 모델에서 억제제 투여 후 혈액 내 DNA의 양적 변화 ② 세포 모델에서 억제제 처리를 통한 (N)ET formation 억제 조사 ③ 혈전생성 모델에서 억제제 처리를 통한 혈전생성 억제 조사

• 기존의 연구는 세포밖에서의 HMGB1 역할에만 집중되어, 염증 질환을 포함한 다양한 질환에서 중요한 역할을 하는 HMGB1이 면역세포에서 분비되는 과정에서 세포질에서 수행하는 역할을 간과하였음. 본 연구자는 뇌졸중 동물 모델과 활성화된 1차배양 microglia에서 공히 HMGB1이 세포질에 존재하는 것을 확인하였으며 본 연구자의 제안의 근거가 되는 선행연구 결과를 확보하고있음 • 본 연구에서는 동물 모델을 사용한 뇌졸중연구, 뇌졸중에서의 HMGB1의 중요성, 그리고 염증 관련 한 오랜 연구경험을 기반으로 수행될 것이며, 15 편의 논문으로 보고한 선행연구와 미보고한 선행연구를 기반으로 함. (1) 1차년도: 뇌졸중에서 NOD2 매개 염증 유도의 중요성 및 세포질 HMGB1의 NOD2 조절 작용 규명 • 연구의 배경: 본 연구자는 뇌졸중에서 세포밖으로 급격하게 분비 축적된 HMGB1에 의한 염증악화 작용을 연구해 지난 10년 동안 보고해왔음. 또한 직접적인 선행연구로 (1) 활성화된 면역세포에서 HMGB1이secretion되는 과정에서 세포질에 상당 기간 머무는 것, (2)활성화된 microglia에서 HMGB1-NOD2의 직접 결합을 확인하였음. 이를 근거로, 본 과제에서는 세포질 HMGB1이 microglia 세포질에 존재하는 PRR인 NOD2를 활성화시켜 염증을 악화시키는 것을 규명하고자 함. • 연구 내용 및 범위 : 뇌졸중 동물모델인 Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO)를 사용하여 NOD2의 시공간적 활성화와 penumbra에서 염증 확대를 조사하고 그 기전을 1차 배양 소교세포를 사용하여 확인함. ① 뇌졸중 동물모델에서의 NOD2의 염증유도 확인 ② 활성화된 microglia에서 NOD2의 중요성 조사 및 HMGB1->NOD2 조절 작용 규명 ③ HMGB1에 의한 NOD2의 조절의 분자기전 규명 2차년도 : 뇌졸중 후 HMGB1의 inflammation (NOD2)-autophagy (Beclin) 상호 전환 조절 규명 • 연구의 배경: 세포질 HMGB1-NOD2결합의 분자 기전을 조사하는 한편, starvation에서 보고된 세포질 HMGB1-Beclin 상호작용을 염증 상황에서 조사하여 뇌졸중 후 HMGB1의 inflammation-autophagy 상호 전환 조절 매개자 역할과 염증유도를 통한 뇌졸중 후 신경계 손상과정의 중요성을 규명하고자 함. • 연구 내용 및 범위: 1차 배양 소교세포를 사용하여 HMGB1-NOD2결합 시 HMGB1의 modification, NOD2 하위인자들의 직접 결합, 각 신호 전달과정의 stress 특이성 등을 조사하고자 함. ① HMGB1-NOD2 복합체 형성 분자 기전 규명 ② HMGB1의 NOD2 vs Beclin와의 stress 특이적 선택 결합양상 규명 ③ 뇌졸중 후 HMGB1의 inflammation-autophagy 상호 전환 조절 3차년도 : 세포질 HMGB1매개 염증유도 제어 및 신경보호 작용 강화 방안 제안 • 연구의 배경 : 본 연구자는 선행연구를 통해, HMGB1-NOD2결합 시 HMGB1의 NOD2 binding site에 대한 정보를 가지고 있으며, 이를 근거로 HMGB1-NOD2결합 억제 방안을 확보하고 있음. 이를 활용하여 세포밖 HMGB1이 역할 제어와 함께 microglia에서의 세포질 HMGB1 억제를 통한 뇌졸중 후 신경 보호 효과는 물론 기타 신경계 염증 질환에 적용할 수 있는 가능성을 제안하고자 함. • 연구 내용 및 범위: 3차년도 연구 범위 및 내용은 다음과 같음. ① HMGB1-NOD2 결합의 binding site 규명 ② 세포질 HMGB1 매개 염증유도 제어방안 강구 및 이를 통한 항염증/신경 보호 확인 ③ 세포질 HMGB1의 새로운 기능의 타 질환 확대 적용