본 연구의 최종목표는 대표적인 흥분성 신경전달 물질 (neurotransmitter)인 glutamate가 뇌졸중 후 뇌신경세포의 흥분독성 (excitotoxicity) 을 일으킬 뿐만 아니라 면역세포의 이동을 유발하는 chemokine의 역할을 하고 더 나아가 extracellular traps(ETs)를 발생시키는 유도자(inducer)의 역할을 하는 인자로 제시하고 그 작용 기전을 규명하는 것임. 상기 목표는 뇌졸중 후 급성 염증과 만성 염증을 유도하는 인자로써의 glutamate의 중요성을 뇌졸중 동물 모델을 대상을 규명할 것임. 본 과제에서는, 뇌졸중 후 급격히 증가하는 glutamate가 뇌졸중 초기 neutrophil의 migration과 NETs의 형성하여 급성 염증을 발생시키고 만성염증에서는 macrophage의 migration과 ETs 형성을 통한 뇌경색 확장에 대한 기전 규명할 수 있는 방안을 강구하고자함. 이를 위하여 다음의 구체적 목표를 가지고 연구 수행을 하고자함. (1) 뇌졸중 모델의 확립과 면역세포의 시공간적 거동 및 작용규명 (2) CSF와 혈중에 축적되는 glutamate 확인과 ETs 발생의 시공간적 양상 확인 (3) 1차 세포를 활용한 Glutamate에 의한 면역세포의 migration 기전 규명 (4) co-culture system을 활용한 glutamate에 의한 extracellular traps (ETs) 발생기전 규명 (5) Glutamate 억제제 또는 ETs 억제제를 상용한 뇌졸중 후 염증 억제 방안 강구 (6) 뇌졸중 이외의 중추신경계급성질환 후 염증 조절에 동일 기전 적용을 위한 기반 확보

본 과제는 신경계에서 가장 풍부한 신경 전달물질인 glutamate가 뇌졸중 후 나타나는 염증 반응에서 면역세포이동을 유도하는 chemoattractant 역할과 extracellular traps (ETs)의 inducer 역할을 하는 것을 보이고, ETs 생성 조절을 통해 뇌 손상을 억제할 수 있는 방안을 강구함. 더 나아가 본 연구 결과를 활용하여...

1차 연도 (2021) 개발 목표 1 : 뇌졸중 후 HMGB1 혈장축적 과 NETosis 유도 (뇌조직/뇌혈관) 및 혈소판 활성화 기전 규명 • 연구의 배경: HMGB1은 대표적인 DAMP molecule로 뇌졸중 후 급격히 세포밖으로 유리되어 혈장(및 CSF)에 과량 축적됨 그동안 HMGB1 연구는 뇌조직내 parenchymal cell (neuron, microglia, astrocyte) 관련 연구에 집중하여 염증 유도/악화 조절 작용이 보고됨. 본과제에서는 뇌졸중 후 혈관내에 축적된 HMGB1의 혈관내피세포, 면역세포, 혈소판 활성화와 상호조절 작용을 주목하여 조사함. • 연구내용 및 범위: ① 뇌졸중 후 HMGB1의 혈장내 축적조사 ② 뇌혈관내 neutrophil 조기 활성화, 혈소판 활성화와 NETosis 유도: HMGB1 역할 및 분자기전 조사 ③ HMGB1-PAD4 상호조절을 통한 혈액응고인자 활성화 조사 ④ recurrent stroke 동물모델 (MCAO+photothrombosis): 다양한 조전에서 2차혈전생성 동물모델 제작 2차 연도 (2022) 개발 목표 2 : 뇌졸중 후 Intravascular/parenchymal NETosis 유도기전 및 중요성, 그리고 HMGB1 작용 규명 • 연구의 배경: HMGB1의 platelet, thrombosis 관련 기능은 다양한 질병상태의 개별적 보고가 있으나 본 과제를 통하여 2차 혈전생성과 연관하여 종합적 접근을 수행함. 2차혈전 형성 (Recurrent stroke) 동물모델은 현재 셑업하여 확보하고있으며 본 과제를 통하여 2차 경색의 형성부위, 크기, 조직병리 및 분자마커 등의 분석을 1차경색후 분비된 HMGB1과 연결하여 체계적으로 분석 예정임. • 연구 내용 및 범위 : ① neutrophil-microglia 상호작용의 염증악화 사이클에 HMGB1 역할 규명-reduced type HMGB1 역할 조사 ② 뇌혈관내 NETosis-혈소판 상호작용을 통한 thrombosis 유도: HMGB1 양방향 중심조절자 역할 규명 ③ Recurrent stroke 동물모델 분석: 2차 혈전생성 과정에서의 HMGB1 작용 기전 규명 3차 연도 (2023) 개발 목표 3 : 뇌졸중 후 혈관내 혈전형성 관련 세포 및 인자의 유도/활성화 관련 HMGB1 작용기전 규명 • 연구의 배경: 본 연구자는 뇌졸중 후 뇌혈관내에 NETs 성분 (free DNA, histone.)과 함께 피브리노겐, tissue factor (TF), TF inhbitor (TFPI) 등 혈액응고인자가 축적되며 뇌졸중 후 뇌혈관내에 축적된 HMGB1이 이들의 중요 조절인자로 작용하여 2차혈전 생성을 유도함을 조사하고자 함. • 연구 내용 및 범위 : ① Intravascular HMGB1 매개 혈전 형성인자 (fibrinogen, TF, TFPI, VWF) 발현 및 활성 조절 조사 ② NETosis-HMGB1-thrombosis 매개 2차 혈전 형성의 분자기전 규명: 리셉터 및 신호전달계 조사 ③ HMGB1-PAD4 조절의 역할: PAD4에 의한 HMGB1, 혈액응고인자 modification 역할 조사 ④ Recurrent stroke model분석: HMGB1 중요성 규명, PAD4 억제제 효과 조사 4차 연도 (2024) 개발 목표 4 : 노화뇌를 사용하여 뇌졸중 후 2차 손상에서의 HMGB1의 중요성 확인 및 제어 방안 규명 • 연구의 배경: 노화에 따른 HMGB1의 뇌조직 및 혈액내 축적과 2차손상 관련성을 통한 HMGB1 역할 확인 및 1차 뇌졸중 후 HMGB1 작용 각 단계의 조절을 통한 (양, 분비, 분비후 작용, protein binding 등) 뇌혈관내 2차 손상 제어 효과 조사함. • 연구 내용 및 범위 ① 노화쥐의 뇌혈관내 HMGB1 축적과 2차 손상유도 역할 규명 ② 노화에 따른 HMGB1 type (redox-type)-특이적 리셉터와 신호전달계 조절 조사-중요성 검증, 제어방안 강구 ③ 뇌졸중 후 2차 손상억제제 발굴: HMGB1 억제제 및 기확보 아스피린 변이체 효과 확인 및 신규제재 발굴

본 연구는 뇌졸중 후 증가하는 extracellular traps formation이 혈전생성을 통하여 뇌졸중 재발을 유발하는 기전을 밝히고 제어방안을 강구하는 것을 목표로 다음과 같은 연구를 진행함. 1. transient MCAO와 permanent MCAO 동물모델을 제작 (1년차) ① 뇌졸중 동물모델에서 occlusion 이후 시간에 따른 혈관 내 면역세포 분포 변화 ② 뇌졸중 동물모델의 occlusion 시간 차이에 기인한 중증도에 따른 혈관 내 면역세포 분포 변화 ③ 뇌졸중 후 시간과 중증도에 따른 혈중 DNA 및 extracellular traps의 구성물의 양적 변화 조사함 2. 뇌졸중 후 혈액 내 면역세포의 lysis 진행 기전과 혈전생성 모델 확립 (2년차) ① 뇌졸중 후 분리된 neutrophil 또는 macrophage에서 발현되는 cytoskeletal protein의 분해효소 조사 ② Extracellular trap 구성물을 활용한 혈전생성 모델 확립 ③ Ex vivo 혈전생성 모델 확립 ④ Neutrophil 또는 Macrophage를 활용하여 NETosis 또는 ETosis와 혈소판 상호작용을 통한 혈전생성 모델 확립 3. 뇌졸중 동물 모델과 혈전생성 모델에서 억제제 투여 통한 뇌졸중 재발 억제 기전 확립 (3년차) ① 뇌졸중 동물 모델에서 억제제 투여 후 혈액 내 DNA의 양적 변화 ② 세포 모델에서 억제제 처리를 통한 (N)ET formation 억제 조사 ③ 혈전생성 모델에서 억제제 처리를 통한 혈전생성 억제 조사