편집자께, 핵수질 세포(nucleus pulposus cells, NPCs)의 증식 감소 및 노화 증가가 추간판(intervertebral discs, IVDs)의 노화 과정과 연관되어 있으며, 그 결과 추간판 퇴행(intervertebral disc degeneration, IVDD)에 기여한다. 또한 노화 방지 단백질 클로토(Klotho, KL)의 결함 있는 발현은 IVDD를 포함한 다양한 연령 관련 질환과 연관된다. 본 연구의 결과는 NPCs에서 KL 발현이 감소하는 것이 자가포식의 변화, 미토콘드리아 기능장애, 그리고 세포 노화를 유발하는 핵심 요인임을 시사하며, IVD 퇴행의 분자적 기전과 관련된 새로운 통찰을 제공한다. KL 단백질의 세포 노화에서의 역할을 고려할 때, IVDD에서의 잠재적 기능이 제안된 바 있다(보충 파일 1, 주 S1). 우리는 인간 NPCs와 IVD 조직으로부터 얻은 두 데이터셋(GSE122429 및 GSE186542)에서 KL 및 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 구성 성분의 유전자 발현을 조사하였다(보충 파일 2, 방법 S1). 배아 또는 만능줄기세포로부터 분화된 NPCs는 KL과 COL2A1이 증가하였으며(그림 1a–d 및 S1a–f), 이는 추간판의 잠재적 손상 복구 가능성을 시사한다(주 S2). 반면, 퇴행성 IVD 조직의 유전자 발현 분석에서는 KL 발현이 유의하게 감소하여, 건강한 추간판을 유지하는 데 있어 KL의 필수적 역할을 강조하였다(그림 1e–g 및 S1g–i; 주 S2). 또한 생체 내 마우스 연구에서는 노화된 IVD가 KL 및 그 공동수용체인 FGF-23의 감소와 연관되어 있었고(보충 파일 3, 방법 S2, 그림 1h 및 S2a), 세포노화 관련 마커의 증가도 확인되었다(그림 1i 및 S2b). 이는 KL 관련 세포 노화가 IVDD에 미치는 영향을 부각한다(주 S3). 우리는 더 나아가, 더 나이 든 마우스(그림 S3a)의 추간 요추 부위로부터 유래한 마우스 NPC(mNPCs)의 세포 역학을 탐색하였다. 1년령 마우스에서는 성장 속도 감소, 형태의 불규칙성, 그리고 5번째 계대(passage)에서의 클론형성 잠재력 감소로 인해 재생 능력이 저하되었으나, 1개월령 마우스의 mNPCs는 0–5번째 계대 동안 강한 성장 잠재력과 규칙적인 형태를 보였다(그림 1j–n). 또한 노화된 마우스로부터 유래한 NPCs에서는 노화 관련 β-galactosidase(SA-β-GAL) 활성 및 p53, p21, p16과 같은 다른 노화 마커의 증가가 관찰되었고, IL1-β 수준도 더 높았다(그림 1o, p 및 r). 노화된 NPCs에서는 계대가 더 진행될수록 KL과 ACAN의 발현이 감소하였으며, 젊은 마우스의 NPCs와 달리 matrix metalloproteinase-13(MMP-13) 수준은 증가하였다(그림 1q). GSE113199 데이터셋을 이용한 보완 분석도 이러한 결과를 뒷받침하였으며, IL1-β 처리 시 KL, ACAN, COL2A1의 발현이 감소하였다(그림 1s–v 및 S3b–d). 추가적인 세부 내용은 주 S4에 제시되어 있다. 더불어, 사람 NPC(hNPCs)를 대상으로 한 시험관 내 계대 배양 실험에서는 세포 인구 누적 배양 횟수의 수(NCPD)가 감소하고, 세포 인구 누적 배양 시간(CPDT)이 증가하는 것이 확인되었다(보충 파일 4, 방법 S3, 그림 2a). 초기 계대 세포(P0–P5; EA-hNPCs로 명명)는 후기 계대 세포(P10–P13; LA-hNPCs로 명명)와 비교하여 상대적으로 높은 KL 및 FGF-23 단백질 발현을 보였다(그림 2b). 자세한 내용은 주 S5에 포함되어 있다. 우리는 NCPD, CPDT, 그리고 KL 단백질 발현을 학습 데이터로 사용하여 LA-hNPCs와 건강한 EA-hNPCs를 포함하는 신경망을 심층 분석하였다(보충 파일 5, 방법 S4). 그 결과는, 이 모델이 EA-hNPCs에서는 KL 발현을 안정적으로 유지한다고 정확히 예측·분류하지만 LA-hNPCs에서는 유의하게 감소함을 확인하였고, 이는 증식 능력의 변화와 상관관계를 보였다(그림 2c 및 d 및 S4–S7, 표 S1). 추가 탐색은 주 S6에 제시되어 있다. 시험관 내 배양 동안 hNPCs의 증식 능력은 세포 형태, BrdU 삽입, 그리고 EA- 및 LA-NPC에서의 클론형성 능력을 확인함으로써 평가하였다. 조기 세포 노화는 SA-β-GAL 활성, 자가포식 플럭스 활성, 미토콘드리아 생체에너지 분석, 그리고 IL1β 수준과 같은 염증성 마커를 포함한 다른 기능성 분석을 통해 평가하였다(보충 파일 6, 방법 S5–S12, 표 S2). 실제로 LA-hNPCs는 세포 형태 변화, 세포노화 및 세포사멸 증가, IL1β 수준 상승, 증식률 감소, 그리고 ECM 발현의 변화가 나타났으며, 그 결과 조기 세포노화 및 IVDD 표현형이 유도되었다(그림 2e–l). LA-hNPCs에서는 자가포식 활성 감소와 미토콘드리아 ROS 수준 증가가 관찰되었고, 생체에너지 프로파일링에서 뚜렷한 전환이 나타났다(그림 2m–r 및 S8a, b). 또한 LA-hNPCs에서의 생체에너지 프로파일링은 산화적 인산화 및 해당 작용(glycolytic flux)의 증가와 함께 유의한 변화 양상을 보였으며(그림 2s–z 및 S8c–e), 이는 증가하는 영양 요구에 대한 반응으로 에너지 대사의 전환이 일어났음을 시사한다. 자세한 내용은 주 S7에 제시되어 있다. hNPCs에서 KL을 억제(knockdown)하면 세포 성장 저하, 미토콘드리아 ROS 증가, 그리고 호흡(respiration) 양상의 변화가 유발되었다(보충 파일 7, 방법 S13, 그림 3a–i). 더 나아가 KL 발현의 감소는 자가포식 감소, 세포노화의 가속, 그리고 ECM 균형의 붕괴를 초래하였다(그림 3j–q). 이러한 결과는 세포 항상성 유지 및 IVDD 예방에서 KL의 중요한 역할을 강조한다. 추가 논의는 주 S8에 포함되어 있다. 또한 재조합 KL(rKL) 처리에서는 LA-hNPCs에서 세포 증식을 촉진하여 성장 잠재력이 증가하고, 산화 스트레스가 감소하며, 미토콘드리아 기능이 향상되는 것이 관찰되었다(보충 파일 8, 방법 S14, 그림 4a–g 및 S9a–d). 추가 결과는 주 S9에서 논의된다. 3차원 세포 배양 분석에서 EA-hNPCs 스페로이드는 지속적으로 성장한 반면, LA-hNPCs 스페로이드는 성장 잠재력을 상실하였다(방법 S15, 그림 4h). 흥미롭게도 rKL 처리는 LA-hNPCs 스페로이드에서 성장 활성을 회복시켰다. rKL 처리는 항산화 효과를 유도하고 KL 발현 및 자가포식 활성을 증가시켰으며(그림 4i 및 j와 S10a, b), 이는 스페로이드 성장 역학의 조절, 산화 스트레스 감소, 그리고 자가포식 과정 촉진 측면에서 rKL의 다양한 치료 잠재력을 시사한다. 이는 주 S10에서 추가로 논의된다. 또한 자가포식 억제제인 클로로퀸(chloroquine, CQ)과 rKL을 병용했을 때, KL과 연관된 보호 기능은 자가포식 감소, 미토콘드리아 ROS 증가, 그리고 미토콘드리아 항상성의 붕괴로 인해 손상되었음이 확인되었다(그림 4k–u). 자가포식을 차단하면 rKL로 유도된 ECM 분비가 감소하고 세포노화가 촉진되어, 자가포식 조절을 통한 rKL의 치료 효과에서의 잠재적 역할을 시사한다. 추가 결과는 주 S11에 제시되어 있다. 결론적으로, 본 포괄적 연구는 노화된 NPC에서의 대사 변화와 함께 자가포식에서 KL이 유의미한 역할을 하며, 미토콘드리아 기능 장애 및 해당 작용(glycolysis) 증가를 포함한다는 점을 보여주었다(보충 파일 9, 주 S12, 그림 S12). 이러한 결과는 KL 관련 경로를 표적화하는 것이 IVDD의 지연 또는 예방을 위한 치료 전략을 제공할 수 있음을 강조한다. 특히 rKL 치료는 IVDD를 다루고, 잠재적으로 다른 연령 관련 질환의 완화에도 기여할 수 있는 유망한 접근으로 부상한다. M.E.B.는 개념을 구상하고 원고를 작성하였으며 모든 원래의 그림을 제작하였다. D.S.M.은 데이터를 분석하고 원고를 교정하였다. T.H.L.은 실험을 지원하고 원고를 교정하였다. J.S.H.는 실험을 지원하고 원고를 교정하였다. N.N.Q.와 R.F.H.는 실험을 지원하였다. J.Y.는 원고를 교정하였다. W.K.는 원고를 교정하였다. D.K.L.은 원고를 교정하였다. S.P.Y.는 원고를 교정하였다. J.H.B.는 원고를 교정하고 재정 지원을 제공하였다. D.R.K.는 개념을 구상하고 재정 지원을 제공하였으며 모든 그림을 편집하고 원고 작성에 기여하였다. 모든 저자는 출판된 원고를 읽고 동의하였다. 저자들은 모든 실험실 구성원에게 특별한 감사를 전한다. 저자들은 이해상충이 없음을 선언한다. 본 연구는 한국 국립연구재단(National Research Foundation of Korea)을 통한 Basic Science Research Program의 지원금(RS-2023-00219399, RS-2023-00238051)으로 수행되었다. 모든 동물 실험은 경상국립대학교(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인(GNU-240702-M0130)을 받았으며, 대한민국 경상국립대학교 IACUC 지침에 따라 수행되었다. 본 연구에서 분석한 RNA sequencing 데이터셋은 GEO 데이터베이스(GSE11224429, GSE186542, GSE113199)를 통해 Gene Expression Omnibus(GEO) 저장소에서 이용 가능하다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi). 모든 데이터는 본 논문 및 부가정보에 포함되어 있으며, 합리적인 요청 시 교신저자에게서도 제공받을 수 있다. 참고로, 출판사는 저자들이 제공한 부가정보의 내용 및 기능에 대해 책임지지 않는다. 부가정보의 누락을 제외한 모든 문의는 해당 논문의 교신저자에게 전달되어야 한다.

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