배경: 급성 골수성 백혈병(AML)은 여전히 중요한 도전 과제로 남아 있으며, 집중적 화학요법 치료는 제한된 효능을 보이고 다른 혈액 종양과 대조적으로 약물 표적화 가능한 표적이 부족하다. 엑소좀은 세포에서 유래한 나노분자로서 모세포의 상태를 반영하며, 질환 바이오마커의 발견과 표적 치료에 대한 기회를 제공한다. AML 유래 엑소좀의 단백질체(proteomic) 분석은 제한된 선행 연구에도 불구하고 약물 표적화 가능한 표적을 식별할 수 있을 가능성이 있다. 본 연구에서는 AML에서 표적 발견 도구로서 엑소좀의 잠재력을 조사하고자 하였다. 방법: 우리는 HL-60, KG-1 및 THP-1 세포주로부터 유래한 AML 엑소좀에 대해 섬유아세포 및 중간엽 줄기세포를 대조군으로 사용하여 단백질체 분석을 수행하였다. 각 세포주의 엑소좀을 분리한 후, 여과기 기반 시료 전처리(filter-aided sample preparation, FASP)로 소화하고, tandem mass tag(TMT) 시약을 이용한 등질량 태깅(isobaric tagging)을 수행하였다. 이어서 고-pH 역상 액체 크로마토그래피(high-pH reversed-phase liquid chromatography)로 시료를 분획하고, Q-Exactive Orbitrap 하이브리드 질량분석기로 분석하였다. 단백질체 데이터는 Proteome Discoverer 2.1에서 SEQUEST로 평가하였으며, false discovery rate를 1%로 설정하였다. 차등 발현 단백질(differentially expressed proteins, DEPs)을 식별하고 상호작용 네트워크에서 시각화하였으며, DAVID 소프트웨어를 사용하여 유전자 온톨로지 생물학적 과정(GOBP)을 분석하였다. 단백질-단백질 상호작용은 STRING 소프트웨어를 이용해 분석하였다. 단백질체 분석을 바탕으로 우리는 AML 세포에 대한 잠재적 약물 표적화 표적으로 BTK 관련 경로를 확인하였다. AML 세포를 BTK 억제제인 ACT와 함께 다양한 노출 시간 및 세포 밀도에서 배양하였다. 세포 생존율과 증식률은 CCK-8 분석으로 평가하였다. BTK 활성과 신호전달은 웨스턴 블롯 분석 및 AML 유래 엑소좀의 면역세포화학을 통해 평가하였다. 세포사는 Annexin-V & PI apoptosis kit 및 FACS 분석으로 평가하였다. 통계 분석은 유의성을 확인하기 위해 수행되었다. 결과: 세 종류의 AML 세포 유형에서 유래한 엑소좀의 단백질체 분석은 LC-MS를 통해 서로 다른 단백질 프로파일을 보여주었으며, 총 2450개의 고유 단백질이 확인되었다(그림 1A). KG1, HL60 및 THP1에서 상향 조절 DEPs의 수는 각각 438, 434 및 408이었고, 하향 조절 DEPs의 수는 각각 126, 118 및 89였다(배수변화 >1.5 또는 <0.67, P<0.05). 유전자 온톨로지 분석에서는 세포 이동, T-세포 경로, 세포 손상 및 소포(vesicle) 형성 경로를 포함하는 네 가지 주요 생물학적 과정 범주가 확인되었다. STRING 소프트웨어를 사용한 단백질-단백질 상호작용 조사 결과, 바이오마커 후보로서 티로신 키나아제 SYK와 LYN을 선정할 수 있었다. 두 키나아제는 B-세포 항원 수용체 신호전달에서 핵심 분자인 BTK를 조절한다. SYK와 LYN은 엑소좀에서 풍부하게 존재하는 것으로 확인되었으며, 수용자 세포에서 BTK의 인산화를 촉진하였다(그림 1B). AML 세포주를 대상으로 한 세포 생존율 실험에서는 ACT 처리 시 생존율이 감소함이 관찰되었다. 생존율은 노출 시간과 세포 밀도가 증가할수록 감소하였고, 48시간 동안 1,000 nM ACT에서 가장 큰 효과가 관찰되었다(그림 2A). 이는 HL-60 및 KG-1 세포주에서 유의한 세포 수 및 증식률의 감소와 함께 나타났으며(그림 2B), 웨스턴 블롯 분석에서는 48시간 시점에 아칼라브루티닙(1,000 nM) 처리로 인해 BTK 하위 신호전달(P-BTK, PKC 및 p-ERK)이 유의하게 감소함이 확인되었다(그림 2C). PCNA 및 Cyclin D1과 같은 증식 관련 표지자 또한 유의하게 감소하였다. 또한 LYN과 SYK는 HL-60 및 THP-1 세포주의 엑소좀에서 감소하였다. ACT에 의한 P-BTK 및 Cyclin D1의 억제는 면역형광(면역세포화학) 분석을 통해 추가로 확인되었다. 마지막으로, 아칼라브루티닙(ACT)은 아폽토시스 분석에서 확인된 바와 같이 AML 세포주에서 세포사를 촉진하는 것으로 나타났으며, 1,000 nM ACT를 72시간 노출한 세포에서 가장 유의한 증가가 관찰되었다(그림 2D). 결론: 종합하면, 본 연구의 결과는 아칼라브루티닙이 AML 세포에서 증식을 감소시키고 세포사를 유도함을 보여주며, 이는 AML 치료에서 BTK 억제제의 잠재력을 시사한다. 이러한 효과는 AML 유래 엑소좀의 단백질체 분석을 통해 설명할 수 있었다. 다만, 엑소좀을 바이오마커 및 약물 표적화 표적으로서 임상적으로 활용하기 위해서는 추가 연구가 필요하다.
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