주요 연구내용을 아래와 같은 3단계로 구분할 수 있음. 단, 필요시 순차적으로 진행하지 않고 각 단계별 연구를 동시에 진행함. 1차년도: 새로운 Hippo 신호회로 상위 조절자로서 미토콘드리아 스트레스의 역할 규명 2차년도: YAP/TAZ 의존성 미토콘드리아 역행신호 네트워크 규명 3차년도: Hippo 신호회로 조절을 통한 비알콜성지방간질환 제어의 새로운 치료 표적 제시 연차별 세부 연구 범위 및 목표는 아래와 같이 설정함. [1차년도] 새로운 Hippo 신호회로 상위 조절자로서 미토콘드리아 스트레스의 역할 규명 1. 지방산 및 미토콘드리아 스트레스 유도제 스크리닝을 통한 YAP/TAZ 활성 자극 및 경로 탐색 - CCCP, CDDO-Me, MitoBloCK-6, Tunicamycin, HisOH 처치 후 YAP 활성 관찰 2. YAP/TAZ 활성과 미토콘드리아 활성산소(mtROS), 미토콘드리아 막전위(MMP), 미접힘단백질 반응(UPRmt), 통합적 스트레스 반응(ISR) 마커의 상관관계 분석 - MitoSOX, TMRE 유세포분석 및 eIF2α, ATF4, CHOP 단백질 마커를 활용 3. ρ0(미토콘드리아 고갈) 세포주의 구축 및 이를 이용한 미토콘드리아의 YAP/TAZ 활성 조절 기여도 검증 - EtBr 처치를 통해 미토콘드리아 고갈을 유도하고 CCCP에 의한 YAP 활성화 관찰 4. 미토콘드리아 스트레스에 의한 YAP/TAZ 활성화를 매개하는 Hippo 신호회로 내 상위 조절 인산화효소(MST1/2, MAP4K, LATS1/2) 및 신호전달 경로 규명 - 기구축하여 보유한 MST1/2, MAP4K4/6/7, LATS1/2 knockout 세포주를 활용하여 미토콘드리아 스트레스 신호 이동경로 관찰 5. 미토콘드리아 스트레스 상황에서 YAP/TAZ의 핵내 이동 및 전사 활성 조절 관찰 - CCCP 처치 후 CTGF, CYR61 등 YAP/TAZ의 대표적 타겟 유전자 관찰 [2차년도] YAP/TAZ 의존성 미토콘드리아 역행신호 네트워크 규명 1. CRISPR-Cas9를 이용한 다양한 YAP/TAZ 결손 간세포주 구축 - HepG2, AML12, THLE-2 세포주에서 YAP/TAZ 결손 단일클론 세포 분리 2. YAP/TAZ 결손 세포주에서 미토콘드리아 스트레스 신호 차단 및 세포 손상 억제 가능성 탐색 - WT 및 YAP/TAZ KO 세포에서 CCCP 처치에 의한 간 세포 손상 및 염증 유도 분석 3. YAP/TAZ 의존적 미토콘드리아 스트레스 타겟 유전자 네트워크 탐색 - GEO database 분석을 통한 미토콘드리아 역행신호 유전자 발굴 - WT 및 YAP/TAZ KO 세포에서 미토콘드리아 역행신호 유전자 발현 차이 관찰 4. 미토콘드리아 스트레스와 Hippo 신호회로와의 연결 기전 규명 - CCCP에 의한 미토콘드리아 전자전달계 또는 미토콘드리아 단백질 수송체와 Hippo 신호회로 상위 조절자의 물리적 상호작용 분석 [3차년도] Hippo 신호회로 억제를 통한 비알콜성 지방간 제어의 새로운 치료 표적 제시 1. 지질 축적에 의한 미토콘드리아 역행신호 활성화 및 YAP/TAZ 의존성 규명 - WT 및 YAP/TAZ KO 세포에서 지방산 처치에 의한 미토콘드리아 역행신호 활성 조절 2. 비알콜성지방간질환 및 미토콘드리아 관련 질환에서 Hippo 신호회로 활성 분석 - GEO 데이터베이스의 microarray 및 RNA-seq 데이터를 분석하여 다양한 미토콘드리아 손상 질환에서 YAP/TAZ 표적 유전자 발현 시그니처 분석 3. 비알콜성지방간질환 마우스 모델에서 간 내 미토콘드리아 손상 및 Hippo 신호회로 활성 분석 - 60% 고지방식이 또는 MCD식이 투여 후 간 조직 내 신호 변화 관찰 4. Hippo 신호회로 조절을 통한 비알콜성지방간질환 억제효과 관찰 - YAP/TAZ KO 또는 LATS1/2 KO 동물에서 비알콜성지방간질환 이행여부 변화 관찰 - 고지방식이 및 YAP/TAZ 억제제를 활용하여 발견한 신호네트워크의 생리활성 검증