[최종목표내용]파킨슨병을 중심으로 한 신규 유전자가위 발굴 및 단백질 엔지니어링을 통한 초정밀 유전자가위 원천기술 개발과 범용 플랫폼 구축1. 신규 유전자가위 발굴 및 단백질 엔지니어링을 통한 AAV용 초정밀 유전자가위 개발2. 파킨슨병 대상 초정밀 유전자가위 AAV 개발 및 질병모델 연구3. Base editor 의 기능을 향상 시키는 effector p...

[1차년도 개발 내용] 1. 신규 유전자가위 발굴 및 단백질 엔지니어링을 통한 AAV용 초정밀 유전자가위 개발 ○ 3종 이상의 AAV용 유전자가위 후보 발굴 ○ In-vitro cleavage assay 및 PAM screening을 통한 유전자가위 활성도 평가 2. 파킨슨병 대상 초정밀 유전자가위 AAV 개발 및 질병모델 연구 ○ 유전체, 단백체 분석을 통한 alpha-synuclein 누적 관련된 유전자 및 단백질 발굴 및 alpha-synuclein 유전자 발현 세포 주 확보 ○ 3종 이상의 Neuron targeting AAV serotype 후보군 확보 ○ 형광 단백질 발현을 통한 serotype 별 transfection 효율 확인 3. Base editor 의 기능을 향상 시키는 effector protein 개발 ○ CRISPRa, CRISPRi stable cell line 구축 ○ Base repair mechanism 관련 유전자 데이터베이스 구축 4. 유전자가위 기반 유전자 검출 기술 및 파킨슨병 바이오마커 ○ 파킨슨병 연관 유전자변이 데이터베이스 구축 ○ 파킨슨병 주요 변이 분석 [2차년도 개발 내용] 1. 신규 유전자가위 발굴 및 단백질 엔지니어링을 통한 AAV용 초정밀 유전자가위 개발 ○ 신규 유전자가위의 3D structure modeling ○ 정밀도 향상을 위한 아미노산 residue 후보군 10종 이상 확보 2. 파킨슨병 대상 초정밀 유전자가위 AAV 개발 및 질병모델 연구 ○ SaCas9 유전자가위 기반 AAV vector 제작 ○ serotype genome editing 효율 확인 ○ 파킨슨병 치료 후보 단백질에 대한 KO screening을 통해 단백질들 기능 및 상호 간의 분석 3. Base editor 의 기능을 향상 시키는 effector protein 개발 ○ Base repair gene 대상 gRNA library 구축 ○ CRISPRa, CRISPRi 기반의 유전자 screening system 구축 ○ dCas9-ABE의 효율에 영향을 주는 세포 내 base editing effector 유전자 3종 이상 발굴 4. 유전자가위 기반 유전자 검출 기술 및 파킨슨병 바이오마커 개발 ○ 파킨슨병 진단용 초정밀 유전자가위 시스템 구축 ○ 파킨슨병 진단용 gRNA array 설계 [3차년도 개발 내용] 1. 신규 유전자가위 발굴 및 단백질 엔지니어링을 통한 AAV용 초정밀 유전자가위 개발 ○ Rational design을 통한 초정밀 유전자가위 1종 확보 ○ genome-wide off-target analysis를 통한 초정밀 유전자가위의 정밀도 확인 ○ 초정밀 유전자가위 기반 Base editor 확보 2. 파킨슨병 대상 초정밀 유전자가위 AAV 개발 및 질병모델 연구 ○ 2차년도 선정된 유전자가위 기반 AAV vector 제작 ○ synuclein 억제에 효과적인 유전자 후보 선정 및 최적 가이드 RNA screening 3. Base editor 의 기능을 향상 시키는 effector protein 개발 ○ Base editing effector 발현용 vector 구축 ○ Base editing effector 발현을 통한 dCas9-ABE 효율 증대 효과 검증 4. 유전자가위 기반 유전자 검출 기술 및 파킨슨병 바이오마커 개발 ○ 파킨슨병 진단용 신규 유전자가위 시스템 최적화 ○ 파킨슨 유전자 분석용 알고리즘 개발

1) 폐암 진단 및 치료 현황- 폐암은 전 세계적으로 암 발생률과 사망률 1위이나 흉부방사선촬영 및 흉부 CT 만으로는 조기 진단, 예후 예측, 그리고 동반 진단에 어려움이 많아 정밀한 유전자 진단 기술에 대한 임상 수요가 매우 높음.- 특히 표적항암치료를 위한 동반 진단에는 민감도 특이도가 높은 암 유전자 분석 기술이 필수적임.- 유전자 분석을 위한 침습적인 암 조직 생검은 종양의 위치, 크기, 환자 상태에 따라 조직 채취의 어려움, 위음성, 종양 이질성 (tumor heterogeneity) 미반영 등의 치명적인 단점이 존재함.- 이러한 단점을 보완한 혈액 생검 유전자 검사에 대한 수요가 폭발적으로 증가하고 있음.2) 기술 개발의 필요성- 혈액 생검은 혈액 내 세포유리 DNA (cell free DNA) 중 암세포유래 DNA 를 검사하는 유전자 진단법으로, 평균적으로 암세포 유래 유전자는 정상세포 유래 유전자의 0.1%를 차지함.- 하지만 차세대 염기 서열 분석 기술 (NGS) 의 도입에도 불구하고 기존 혈액 기반 유전자 분석 기술은 저빈도 변이 검출이 어려워 (평균 검출 한계 1%) 높은 임상 수요에도 불구하고 활용이 매우 제한적임.- 따라서 암유전자를 민감하게 검출하기 위해서는 정상세포 유래 유전자 대비 암세포 유래 돌연변이의 비율을 높이는 enrichment 기술이 요구됨.3) 연구 개발의 개요- 본 기업은 크리스퍼 유전자가위를 통해 정상세포 유전자를 제거하여, 암세포 돌연변이 유전자만 증폭시키는 기술을 개발함.- 폐암 환자 검체 연구를 통해 임상 적용이 가능한 혈액 생검 기술 개발, 최종적으로 소량의 피로 주요 암들을 초기에 진단하는 것을 목표함.4) 선행 연구 결과- 초정밀 신규 유전자가위를 포함한 혁신적인 기술 개발을 통해 암세포 돌연변이와 정상세포유래 유전자를 정확하게 구분, 정상 유전자만 제거할 수 있는 원천 기술 획득, 특허 등록 완료 (2019.02.26./등록번호:10-2086689호)- 기존 기술 대비 1000배 이상의 검출률로 0.01%의 암 발현 유전자도 명확하게 진단해낼 수 있음을 확인함.- 비소세포폐암 임상 검체 (조직 및 혈액) 유전자 분석을 통해 본 기술의 우수성을 실증함.

1) 폐암 진단 및 치료 현황 - 폐암은 전 세계적으로 암 발생률과 사망률 1위이나 흉부방사선촬영 및 흉부 CT 만으로는 조기 진단, 예후 예측, 그리고 동반 진단에 어려움이 많아 정밀한 유전자 진단 기술에 대한 임상 수요가 매우 높음. - 특히 표적항암치료를 위한 동반 진단에는 민감도 특이도가 높은 암 유전자 분석 기술이 필수적임. - 유전자 분석을 위한 침습적인 암 조직 생검은 종양의 위치, 크기, 환자 상태에 따라 조직 채취의 어려움, 위음성, 종양 이질성 (tumor heterogeneity) 미반영 등의 치명적인 단점이 존재함. - 이러한 단점을 보완한 혈액 생검 유전자 검사에 대한 수요가 폭발적으로 증가하고 있음. 2) 기술 개발의 필요성 - 혈액 생검은 혈액 내 세포유리 DNA (cell free DNA) 중 암세포유래 DNA 를 검사하는 유전자 진단법으로, 평균적으로 암세포 유래 유전자는 정상세포 유래 유전자의 0.1%를 차지함. - 하지만 차세대 염기 서열 분석 기술 (NGS) 의 도입에도 불구하고 기존 혈액 기반 유전자 분석 기술은 저빈도 변이 검출이 어려워 (평균 검출 한계 1%) 높은 임상 수요에도 불구하고 활용이 매우 제한적임. - 따라서 암유전자를 민감하게 검출하기 위해서는 정상세포 유래 유전자 대비 암세포 유래 돌연변이의 비율을 높이는 enrichment 기술이 요구됨. 3) 연구 개발의 개요 - 본 기업은 크리스퍼 유전자가위를 통해 정상세포 유전자를 제거하여, 암세포 돌연변이 유전자만 증폭시키는 기술을 개발함. - 폐암 환자 검체 연구를 통해 임상 적용이 가능한 혈액 생검 기술 개발, 최종적으로 소량의 피로 주요 암들을 초기에 진단하는 것을 목표함. 4) 선행 연구 결과 - 초정밀 신규 유전자가위를 포함한 혁신적인 기술 개발을 통해 암세포 돌연변이와 정상세포유래 유전자를 정확하게 구분, 정상 유전자만 제거할 수 있는 원천 기술 획득, 특허 등록 완료 (2019.02.26./등록번호:10-2086689호) - 기존 기술 대비 1000배 이상의 검출률로 0.01%의 암 발현 유전자도 명확하게 진단해낼 수 있음을 확인함. - 비소세포폐암 임상 검체 (조직 및 혈액) 유전자 분석을 통해 본 기술의 우수성을 실증함.