돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법
Methods for inducing differentiation of porcine epiblast stem cells to vascular endothelial cell
특허 요약
본 발명은 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포를 VEGF가 최적의 농도로 포함된 배양액으로 배양하여, 혈관내피세포로의 선택적 체외 분화를 유도한 것으로, 이를 통해 분화된 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포는 종양유전자가 포함된 유도만능 줄기세포의 위험성을 배제하여 보다 안전하고, 인공혈관이 수행 불가능한 혈액응고 방지, 혈관 확장 조절 및 혈액내 수송물질의 투과 및 흡수 조절 등의 혈관 본연의 기능이 가능한 혈관질환 모델 생산이나, 혈관 질환 환자에게 이식 가능한 생체 혈관으로 유용하게 활용할 수 있다.
청구항
번호청구항
1

돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포를 10 내지 100 ng/ml의 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)가 포함된 내피세포 성장 기저 배양액(endothelial cell growth basal medium)으로 배양하는 단계를 포함하는, 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법.

2

제 1항에 있어서,상기 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포는 하기와 같은 단계를 통해 수득되는 것을 특징으로 하는, 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법:a) 돼지 체내수정란의 배반엽 상층으로부터 세포덩어리를 분리하는 단계;b) 상기 분리한 세포덩어리를 배양보조세포 위에서 배양하는 단계;c) 상기 배양된 세포덩어리로부터 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포와 배양보조세포를 분리하는 단계; 및d) 상기 분리된 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포의 알칼리인산분해효소(Alkaline Phosphatase, AP)의 발현 여부를 확인하여 선별하는 단계.

3

제 2항에 있어서,상기 d) 단계에 있어서, AP가 발현되지 않는 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포를 선별하는 것을 특징으로 하는, 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법.

4

제 1항에 있어서,상기 내피세포 성장 기저 배양액은 EBM-2(Endothelial Cell Growth Medium-2) 배양액인 것을 특징으로 하는, 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법.

5

제 2항에 있어서,상기 b)단계 중 상기 세포덩어리는 배양 3 내지 5일 마다 콜라겐분해효소 및 디스파제(Dispase)가 혼합된 혼합효소로 20 내지 50℃에서 5분 내지 30분 동안 처리된 후 배양보조세포 위에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법.

6

제 5항에 있어서,상기 혼합효소는 콜라겐분해효소 및 디스파제가 1:1의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는, 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법.

7

제 2항에 있어서, 상기 배양보조세포는 비활성화된 생쥐배아섬유아세포(Irradiated Mouse Embryonic Fibroblasts, iMEF)인 것을 특징으로 하는, 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법.

8

10 내지 100 ng/ml의 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 내피세포 성장 기저 배양액을 포함하는 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도용 배지 조성물.

9

10 내지 100 ng/ml의 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 내피세포 성장 기저 배양액을 포함하는 돼지 배반엽 상층 유래 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도용 키트.