세포질 상분리 현상 실시간 모니터링용 형광 표지인자가 도입된 인간 전분화능 줄기세포 모델 기반 독성 평가 시스템
Toxicity evaluation system based on human pluripotent stem cell model with introduced fluorescent marker for real-time monitoring of cytoplasmic phase separation phenomenon
특허 요약
본 발명은 세포질 상분리 현상 실시간 모니터링용 형광 표지인자 도입 인간 전분화능 줄기세포 모델 기반 독성 평가 시스템에 관한 것으로, CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 상분리 현상을 구성하는 대표적인 단백질 중의 하나인 G3BP1 유전자의 C-말단(terminal) 부분에 형광 표지인자를 영구적으로 내재적인 발현(endogenous expression)을 하는 인간 전분화능 줄기세포를 확립하였고, 상기 인간 전분화능 줄기세포가 삼배엽으로 분화하는데 이상이 없고, 시험물질 처리시 실시간으로 상분리 현상, 구체적으로 스트레스 과립을 형성하는 것을 확인할 수 있어, 인간 전분화능 줄기세포를 이용하여 인체를 구성하는 다양한 세포 및 오가노이드로 분화시킨 다음 다양한 유해인자 노출에 따른 독성을 실시간으로 평가할 수 있는 기술로 유용하게 활용될 수 있다.
청구항
번호청구항
9

제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화된 오가노이드.

1

상분리 현상을 실시간으로 검출하는, G3BP1 유전자의 엑손 12의 3'-말단에 독성 평가용 형광 리포터가 도입된 인간 전분화능 줄기세포.

2

제1항에 있어서, 상기 인간 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell, ESC) 또는 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)인 것을 특징으로 하는 G3BP1 유전자의 엑손 12의 3'-말단에 독성 평가용 형광 리포터가 도입된 인간 전분화능 줄기세포.

3

제1항에 있어서, 상기 상분리 현상은 스트레스 과립 형성인 것을 특징으로 하는 G3BP1 유전자의 엑손 12의 3'-말단에 독성 평가용 형광 리포터가 도입된 인간 전분화능 줄기세포.

4

삭제

5

제1항에 있어서, 상기 독성 평가용 형광 리포터는 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase), 레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 증강된 적색 형광 단백질(enhanced red fluorescent protein, ERFP), 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein, BFP), 증강된 청색 형광 단백질(enhanced blue fluorescent protein, EBFP), 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 증강된 황색 형광 단백질(enhanced yellow fluorescent protein, EYFP), 남색 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 증강된 남색 형광 단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), mCherry 및 DsRed로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 G3BP1 유전자의 엑손 12의 3'-말단에 독성 평가용 형광 리포터가 도입된 인간 전분화능 줄기세포.

6

제1항에 있어서, 상기 독성 평가용 형광 리포터가 도입된 인간 전분화능 줄기세포는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 G3BP1 유전자의 엑손 12의 3'-말단에, 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase), 레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 증강된 적색 형광 단백질(enhanced red fluorescent protein, ERFP), 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein, BFP), 증강된 청색 형광 단백질(enhanced blue fluorescent protein, EBFP), 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 증강된 황색 형광 단백질(enhanced yellow fluorescent protein, EYFP), 남색 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 증강된 남색 형광 단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), mCherry 및 DsRed로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 형광 표지인자를 도입한 것을 특징으로 하는 G3BP1 유전자의 엑손 12의 3'-말단에 독성 평가용 형광 리포터가 도입된 인간 전분화능 줄기세포.

7

제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화된 세포.

8

제7항에 있어서, 상기 세포는 폐 세포, 심장 세포, 혈액 세포, 간 세포, 췌장 세포, 뇌 세포, 소장 세포, 대장 세포, 위 세포, 신장 세포 및 피부 세포 중 어느 하나의 정상 또는 비정상 세포인 것을 특징으로 하는 세포.

10

제9항에 있어서, 상기 오가노이드는 소장, 대장, 간, 췌장, 신장, 뇌, 폐, 심장, 모근, 및 피부 중 어느 하나의 정상 또는 비정상 조직을 모사한 것을 특징으로 하는 오가노이드.

11

제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 인간 전분화능 줄기세포, 이로부터 분화된 세포 또는 오가노이드를 포함하며, 농약; 생활화학 제품 또는 산업용 화학물질; 및 박테리아 또는 바이러스를 포함하는 생물학적 유해인자; 중 어느 하나에 의해 유발된 독성 평가용 조성물.

12

삭제

13

제11항에 있어서, 상기 생활화학 제품 또는 산업용 화학물질은 아비산나트륨인 것을 특징으로 하는 독성 평가용 조성물.

14

제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 인간 전분화능 줄기세포, 이로부터 분화된 세포 또는 오가노이드를 포함하며, 농약; 생활화학 제품 또는 산업용 화학물질; 및 박테리아 또는 바이러스를 포함하는 생물학적 유해인자; 중 어느 하나의 독성 유발 물질의 스크리닝용 조성물.

15

삭제

16

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 sgRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9-sgRNA 벡터; 및 G3BP1 유전자에 형광 리포터 도입을 위한 유전자 삽입(Knock-in) 벡터;로 줄기세포를 형질감염시켜 G3BP1 유전자의 엑손 12의 3'-말단에 형광 리포터를 도입하는 단계;를 포함하는 독성 평가용 형광 리포터가 도입된 인간 전분화능 줄기세포의 제조방법.

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삭제

18

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  1. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 인간 전분화능 줄기세포, 이로부터 분화된 세포 또는 오가노이드에 독성 평가용 시험물질을 처리하는 단계; 및2) 상기 단계 1) 이후에, 실시간 상분리 현상을 확인하여 독성 유발 물질을 예측하는 단계;를 포함하는 독성 유발 물질의 스크리닝 방법.
20

제19항에 있어서, 상기 단계 1)의 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화된 세포는 폐 세포, 심장 세포, 혈액 세포, 간 세포, 췌장 세포, 뇌 세포, 소장 세포, 대장 세포, 위 세포, 신장 세포 및 피부 세포 중 어느 하나의 정상 또는 비정상 세포인 것을 특징으로 하는 독성 유발 물질의 스크리닝 방법.

21

제19항에 있어서, 상기 단계 1)의 오가노이드는 소장, 대장, 간, 췌장, 신장, 뇌, 폐, 심장, 모근 및 피부 중 어느 하나의 정상 또는 비정상 조직을 모사한 오가노이드인 것을 특징으로 하는 독성 유발 물질의 스크리닝 방법.