복어류 종 판별을 위한 유전자 분석 방법
A genetic analysis method for identification of pufferfish species
특허 요약
본 발명은 1) 복어로부터 DNA를 추출하는 단계, 2) CoI 및 Cytb 분자 마커의 증폭 및 시퀀싱을 통한 각각의 염기서열을 결정하는 단계, 3) 상기 결정된 염기서열을 사용하여 NCBI BLASTn을 검색하는 단계, 4) 식별 기준을 만족하는 복어종을 선별하는 단계, 및 5) 상기 3) 단계에서 BLASTn 검색 결과 2개 이상의 복어종으로 판별된 경우 추가 SSR(simple sequence repeat) 마커 분석을 통해 최종 복어종을 선별하는 단계를 포함하는 복어 종 판별을 위한 유전자 분석 방법; 상기 유전자 분석 방법을 포함하는 식용가능한 복어 제품 모니터링 방법; 및 복어종을 판별할 수 있는 마커를 포함하는 복어종 판별용 키트에 관한 것이다.
청구항
번호청구항
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  1. 복어로부터 DNA를 추출하는 단계;2) CoI 및 Cytb 분자 마커의 증폭 및 시퀀싱을 통한 각각의 염기서열을 결정하는 단계로서,상기 CoI 분자 마커는 서열번호 1 및 3, 서열번호 1 및 4, 서열번호 2 및 3, 또는 서열번호 2 및 4로 표시한 프라이머쌍 중 어느 하나에 의해 증폭된 것이며,상기 Cytb 분자 마커는 서열번호 7 및 8로 표시한 프라이머쌍에 의해 증폭된 것인 단계;3) 상기 결정된 염기서열을 사용하여 NCBI BLASTn을 검색하는 단계;4) 서열 유사성(sequence similarity) 99% 이상이고, 쿼리 커버리지(query coverage)가 98% 이상인 것인 식별 기준을 만족하는 복어종을 선별하는 단계; 및5) 상기 3) 단계에서 BLASTn 검색 결과 2개 이상의 복어종으로 판별된 경우 추가 SSR1 또는 SSR2 마커 분석을 통해 최종 복어종을 선별하는 단계로서, 상기 SSR1 마커는 서열번호 13 및 14로 표시한 프라이머쌍에 의해 증폭된 것이며,상기 SSR2 마커는 서열번호 15 및 16으로 표시한 프라이머쌍에 의해 증폭된 것인 단계;를 포함하는 복어 종 판별을 위한 유전자 분석 방법.
2

제1항에 있어서, 상기 복어종은 복섬(T. niphobles), 흰점복(T. poecilonotus), 졸복(T. pardalis), 국매리복(T. vermicularis), 검복(T. porphyreus), 까치복(T. xanthopterus), 까칠복(T. stictonotus), 은밀복(L. spadiceus), 흑밀복(L. cheesemanii), 청밀복(L. lagocephalus) 및 불룩복(S. pachygaster)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 복어 종 판별을 위한 유전자 분석 방법.

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제1항에 있어서, 상기 1)의 복어는 신선한 복어이거나 가공된 제품인 것인, 복어 종 판별을 위한 유전자 분석 방법.

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제3항에 있어서, 상기 가공된 제품은 증류수로 세척하고 95% 에탄올에 보존하는 전처리 단계를 추가한 것인, 복어 종 판별을 위한 유전자 분석 방법.

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제3항에 있어서, 상기 가공된 제품은 냉동, 건조, 볶은 필레, 수프 또는 데친 껍질로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 복어 종 판별을 위한 유전자 분석 방법.

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7

제1항에 있어서, 상기 5)의 SSR1 또는 SSR2 마커는 NGS(Next Generation Sequencing)를 이용하여 동정한 단순 반복 염기서열인 것인, 복어 종 판별을 위한 유전자 분석 방법.

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9

제1항에 있어서, 상기 SSR1 마커는 흑밀복(L. cheesemanii)과 은밀복(L. spadiceus)을 구별하기 위한 것인, 복어 종 판별을 위한 유전자 분석 방법.

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제9항에 있어서, 상기 증폭된 SSR1 마커가 400 bp로 확인되는 경우 은밀복(L. spadiceus)으로 판단하고, 400 bp가 확인되지 않는 경우는 흑밀복(L. cheesemanii)으로 판단하는 것인, 복어 종 판별을 위한 유전자 분석 방법.

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제1항에 있어서, 상기 SSR2 마커는 복섬(T. niphobles)과 황해흰점복(T. alboplumbeus)을 구별하기 위한 것인, 복어 종 판별을 위한 유전자 분석 방법.

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제11항에 있어서, 상기 증폭된 SSR2 마커가 170 bp로 확인되는 경우 복섬(T. niphobles)으로 판단하고, 170 bp가 확인되지 않는 경우는 황해흰점복(T. alboplumbeus)으로 판단하는 것인, 복어 종 판별을 위한 유전자 분석 방법.

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제1항 내지 제5항, 제7항, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항을 포함하는 식용 가능한 복어 제품 모니터링 방법.

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복어종을 판별할 수 있는,(a) CoI 마커의 증폭을 위한 서열번호 1 및 3, 서열번호 1 및 4, 서열번호 2 및 3 또는 서열번호 2 및 4로 표시한 프라이머쌍 중 어느 하나의 프라이머쌍;(b) Cytb 마커의 증폭을 위한 서열번호 7 및 8로 표시한 프라이머쌍; 및(c) SSR1 마커의 증폭을 위한 서열번호 13 및 14로 표시한 프라이머쌍 또는 SSR2 마커의 증폭을 위한 서열번호 15 및 16로 표시한 프라이머쌍 중 어느 하나의 프라이머쌍;을 포함하는 복어종 판별용 키트.

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제14항에 있어서, 상기 복어종은 복섬(T. niphobles), 흰점복(T. poecilonotus), 졸복(T. pardalis), 국매리복(T. vermicularis), 검복(T. porphyreus), 까치복(T. xanthopterus), 까칠복(T. stictonotus), 은밀복(L. spadiceus), 흑밀복(L. cheesemanii), 청밀복(L. lagocephalus) 및 불룩복(S. pachygaster)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 키트.

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제14항에 있어서, 상기 SSR1 마커의 증폭을 위한 서열번호 13 및 14로 표시한 프라이머쌍 또는 SSR2 마커의 증폭을 위한 서열번호 15 및 16로 표시한 프라이머쌍 중 어느 하나의 프라이머쌍은 2개 이상의 복어종으로 판별된 경우 추가 분석시 사용하는 프라이머쌍인 것인, 키트.

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