미토케이마 유전자가 도입된 형질전환 초파리의 제작 및 활용
Construction of mt-Keima reporter Drosophila and its usage
특허 요약
본 발명은 미토케이마(mt-Keima) 유전자를 포함하는 벡터를 초파리에 형질전환시켜 미토케이마 유전자가 도입된 초파리 모델을 제작하여 초파리 각각의 조직에서 미토케이마가 발현됨을 확인하고, 알츠하이머 질병모델 초파리를 제작해 알츠하이머 모델 초파리 뇌의 미토파지 활성이 감소하는 것을 확인하였으며, 미토케이마 발현 초파리를 이용해 생체 미토파지 조절 치료후보 물질 스크리닝 시스템을 구축함으로써, 상기 미토케이마 유전자 형질전환 초파리를 이용해 기존 방법으로 찾을 수 없었던 미토파지 증진 및 억제 인자들을 발굴해 퇴행성뇌질환 예방 또는 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
청구항
번호청구항
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  1. 미토케이마(mt-Keima) 유전자를 초파리 형질전환용 벡터에 클로닝하여 미토케이마 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;2) 상기 단계 1)의 벡터를 초파리에 형질전환시켜 미토케이마 유전자 형질전환 초파리를 제조하는 단계;3) 상기 단계 2)의 형질전환 초파리로부터 공초점 현미경을 이용하여 미토케이마 형광이미지를 얻는 단계; 4) 상기 단계 3)에서 얻은 형광이미지를 구성하는 각 점(pixel)을 녹색 형광 신호의 세기가 가로축, 적색 형광 신호의 세기가 세로축이며, 녹색 형광 신호 및 적색 형광 신호가 모두 약한점이 위치하는 1사분면, 녹색 형광 신호는 약하고 적색 형광 신호는 강한 점이 위치하는 2사분면, 녹색 형광 신호 및 적색 형광 신호가 모두 강한점이 위치하는 3사분면, 녹색 형광 신호는 강하고 적색 형광 신호는 약한점이 위치하는 4사분면의 4개의 분면으로 구성된 점 점도면(pixel dot plot)으로 전환하는 단계;5) 공초점현미경 이미지상의 붉은 점이 상기 단계 4)의 점 점도면(pixel dot plot)상의 2사분면에 위치하도록 사분면 기준선을 조절하는 단계; 및6) 각 사분면에 위치하는 점(pixel)의 수를 산출하고, 하기 수학식 1로 표현되는 수식의 값을 구하는 단계를 포함하는 미토파지 활성 측정방법.[수학식 1](#1은 1 사분면에 표시되는 점(pixel)의 수, #2는 2 사분면에 표시되는 점(pixel)의 수, #3은 3 사분면에 표시되는 점(pixel)의 수, #4는 4 사분면에 표시되는 점(pixel)의 수, #b는 공초점현미경 이미지에서 배경(background)에 해당하는 점(pixel)의 수)
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제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 벡터의 미토케이마 유전자의 발현은 GAL4(galactose responsive transcription factor 4)에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 미토파지 활성 측정방법.

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제 1항에 있어서, 상기 단계 2)와 3) 사이에 상기 단계 2)로부터 제조된 미토케이마 유전자 형질전환 초파리와 모든 조직에서 또는 조직특이적으로 GAL4를 발현하는 형질전환 초파리를 교배하는 단계를 더 포함하는 미토파지 활성 측정방법.

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제 3항에 있어서, 조직특이적으로 GAL4를 발현하는 형질전환 초파리는 근육 특이적 GAL4 발현 초파리(ef2-GAL4), 날개 특이적 GAL4 발현 초파리(MS1096-GAL4), 눈 특이적 GAL4 발현 초파리(eye-GAL4) 및 신경 특이적 GAL4 발현 초파리(elav-GAL4)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미토파지 활성 측정방법.

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제 1항에 있어서, 상기 단계 2)와 3) 사이에 상기 단계 2)로부터 제조된 미토케이마 유전자 형질전환 초파리를 질환모델 초파리와 교배하는 단계를 더 포함하는 미토파지 활성 측정방법.

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제 5항에 있어서, 상기 질환은 미토파지 활성 저해로 인한 것을 특징으로 하는 미토파지 활성 측정방법.

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제 6항에 있어서, 상기 질환은 퇴행성 뇌질환, 심장질환, 간질환 또는 암인 것을 특징으로 하는 미토파지 활성 측정방법.

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  1. 미토케이마(mt-Keima) 유전자를 초파리 형질전환용 벡터에 클로닝하여 미토케이마 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;2) 상기 단계 1)의 벡터를 초파리에 형질전환시켜 미토케이마 유전자 형질전환 초파리를 제조하는 단계;3) 상기 단계 2)로부터 제조된 미토케이마 유전자 형질전환 초파리를 질환모델 초파리와 교배하는 단계;4) 상기 단계 3)으로부터 제조된 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;5) 상기 단계 4)의 피검물질이 처리된 초파리로부터 공초점 현미경을 이용하여 미토케이마 형광이미지를 얻는 단계;6) 상기 단계 5)에서 얻은 형광이미지를 구성하는 각 점(pixel)을 녹색 형광 신호의 세기가 가로축, 적색 형광 신호의 세기가 세로축이며, 녹색 형광 신호 및 적색 형광 신호가 모두 약한점이 위치하는 1사분면, 녹색 형광 신호는 약하고 적색 형광 신호는 강한 점이 위치하는 2사분면, 녹색 형광 신호 및 적색 형광 신호가 모두 강한점이 위치하는 3사분면, 녹색 형광 신호는 강하고 적색 형광 신호는 약한점이 위치하는 4사분면의 4개의 분면으로 구성된 점 점도면(pixel dot plot)으로 전환하는 단계;7) 공초점현미경 이미지상의 붉은 점이 상기 단계 6)의 점 점도면(pixel dot plot)상의 2사분면에 위치하도록 사분면 기준선을 조절하는 단계; 8) 각 사분면에 위치하는 점(pixel)의 수를 산출하고, 하기 수학식 1로 표현되는 수식의 값을 구하여 미토파지 활성을 측정하는 단계; 및[수학식 1](#1은 1 사분면에 표시되는 점(pixel)의 수, #2는 2 사분면에 표시되는 점(pixel)의 수, #3은 3 사분면에 표시되는 점(pixel)의 수, #4는 4 사분면에 표시되는 점(pixel)의 수, #b는 공초점현미경 이미지에서 배경(background)에 해당하는 점(pixel)의 수)9) 피검물질을 처리하지 아니한 대조군과 비교하여 상기 단계 5)의 미토파지 활성을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 질환치료제의 스크리닝 방법.
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