정확한 사람 세포 유래 엑소좀 바이오마커의 분석을 위해 소 태아 혈청 유래 엑소좀의 영향을 최소화하는 방법
Methods of Minimizing the Impact of Fetal Bovine Serum-Derived Exosomes on Accurate Analysis of Human Cell-Derived Exosome Biomarkers
특허 요약
본 발명은 표적 대상체 유래 엑소좀 계수 방법 및 표적 대상체 유래 엑소좀 내 바이오마커 발현 수준 정규화 방법에 관한 것으로, 상세하게는 엑소좀 표면 단백질인 CD63에 대한 면역반응을 통해 형광으로 표지하고 형광-나노입자추적분석기(Flourescent-Nanoparticle Tracking Analysis, Fl-NTA)를 이용해 형광 표지된 입자만이 롱 패스 필터를 통과하도록 하여, FBS 유래 엑소좀은 계수하지 않고, 사람 세포 유래 엑소좀만을 정확하게 계수하는 방법에 관한 것이다.
청구항
번호청구항
1

다음 단계를 포함하는 표적 대상체 유래 엑소좀 계수 방법:대상체로부터 분리된 샘플로부터 엑소좀을 분리하는 엑소좀분리단계; 상기 엑소좀의 표면 단백질을 항체를 이용해 형광으로 표지하는 형광표지단계; 및형광 레이저 및 롱 패스 필터가 구비된 형광-나노입자추적분석기 (Fluorescent-Nanoparticle Tracking Analysis, Fl-NTA)를 이용하여 형광으로 표지된 엑소좀의 입자 수를 측정하는 형광측정단계.

2

제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 형광측정단계로부터 수득한 엑소좀의 입자 수를 상기 대상체로부터 분리된 샘플에 포함된 세포 수로 나누는 단계를 추가로 포함하는 것인, 표적 대상체 유래 엑소좀 계수 방법.

3

제1항에 있어서, 상기 엑소좀의 표면 단백질은 CD63, CD9, CD81, CD29 및 CD44으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 표적 대상체 유래 엑소좀 계수 방법.

4

제1항에 있어서, 상기 엑소좀분리단계는 엑소좀 분리 키트(exosome isolation kit), 초원심분리(ultracentrifugation), 초여과(ultrafiltration), 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF), 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography), 밀도구배법(density gradient ultracentrifugation), 자유유동전기 이동법(free-flow electrophoresis), 여과(filtration), 투석(dialysis), 침전(precipitation) 및 미세유체(microfluidic) 기반 분리로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 수단에 의한 것인, 표적 대상체 유래 엑소좀 계수 방법.

5

제1항에 있어서, 상기 대상체는 사람인 것인, 표적 대상체 유래 엑소좀 계수 방법.

6

다음 단계를 포함하는 표적 대상체 유래 엑소좀 내 바이오마커 발현 수준 정규화 방법:대상체로부터 분리된 샘플로부터 엑소좀을 분리하는 엑소좀분리단계;상기 엑소좀의 표면 단백질을 항체를 이용해 형광으로 표지하는 형광표지단계;형광 레이저 및 롱 패스 필터가 구비된 형광-나노입자추적분석기 (Fluorescent-Nanoparticle Tracking Analysis, Fl-NTA)를 이용하여 형광으로 표지된 엑소좀의 입자 수를 측정하는 형광측정단계;상기 엑소좀에서 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 발현측정단계; 및상기 바이오마커의 발현 수준을 상기 형광측정단계로부터 수득한 엑소좀의 입자 수로 나누는 계산단계.

7

제6항에 있어서, 상기 방법은 상기 형광측정단계로부터 수득한 엑소좀의 입자 수를 상기 대상체로부터 분리된 샘플에 포함된 세포 수로 나누는 단계를 추가로 포함하는 것인, 표적 대상체 유래 엑소좀 내 바이오마커 발현 수준 정규화 방법.

8

제6항에 있어서, 상기 방법은 나노입자추적분석기 (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)를 이용하여 샘플로부터 분리된 엑소좀의 총 입자 수를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 표적 대상체 유래 엑소좀 내 바이오마커 발현 수준 정규화 방법.

9

제8항에 있어서, 상기 방법은 상기 엑소좀의 총 입자 수 대비 형광으로 표지된 엑소좀의 입자 수 비율; 및 바이오마커의 발현 수준;을 곱하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 표적 대상체 유래 엑소좀 내 바이오마커 발현 수준 정규화 방법.

10

제6항에 있어서, 상기 엑소좀의 표면 단백질은 CD63, CD9, CD81, CD29 및 CD44로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 표적 대상체 유래 엑소좀 내 바이오마커 발현 수준 정규화 방법.

11

제6항에 있어서, 상기 엑소좀분리단계는 엑소좀 분리 키트(exosome isolation kit), 초원심분리(ultracentrifugation), 초여과(ultrafiltration), 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF), 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography), 밀도구배법(density gradient ultracentrifugation), 자유유동전기 이동법(free-flow electrophoresis), 여과(filtration), 투석(dialysis), 침전(precipitation) 및 미세유체(microfluidic) 기반 분리로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 수단에 의한 것인, 표적 대상체 유래 엑소좀 내 바이오마커 발현 수준 정규화 방법.

12

제6항에 있어서, 상기 대상체는 사람인 것인, 표적 대상체 유래 엑소좀 내 바이오마커 발현 수준 정규화 방법.

13

제6항에 있어서, 상기 바이오마커는 엑소좀 내 마이크로RNA(microRNA), 핵산, 또는 단백질인 것인, 표적 대상체 유래 엑소좀 내 바이오마커 발현 수준 정규화 방법.