엑소좀 유래 miRNA 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 miRNA 검출 방법
Biosensor for detecting exosome-derived miRNA and method for detecting miRNA using the same
특허 요약
본 발명은 엑소좀 유래 miRNA 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 miRNA 검출 방법에 관한 것으로서, 상기 검출용 바이오센서는 금나노입자에 엑소좀 표면 단백질 특이적 항체 및 miRNA 중합효소 특이적 프로모터가 결합된 것으로서, 이를 이용하여 등온 핵산 증폭 공정을 수행하여 표적 miRNA를 검출할 수 있다. 본 발명에서는 엑소좀의 분리부터 miRNA 추출 및 증폭, 그리고 검출을 하나의 튜브(Tube) 내에서 진행할 수 있으므로 시료를 다른 튜브로 옮기는 복잡함을 개선할 수 있고, 순서대로 시약을 넣은 후 37℃로 가열만 하면 되는 편리함 뿐만 아니라, 시료의 오염 및 miRNA 손실(loss)을 줄일 수 있다.
청구항
번호청구항
1

금나노입자에 엑소좀 표면 단백질 특이적 항체, 및 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터가 결합된 엑소좀 유래 miRNA 검출용 바이오센서.

2

제1항에 있어서, 상기 엑소좀 표면 단백질은 CD63 또는 GAPDH인 것인, 엑소좀 유래 miRNA 검출용 바이오센서.

3

제1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것인, 엑소좀 유래 miRNA 검출용 바이오센서.

4

다음 단계를 포함하는 엑소좀 유래 miRNA 검출용 바이오센서의 제조 방법:금나노입자 표면에 엑소좀 표면 단백질 특이적 항체를 결합시키는 항체 결합 단계; 및상기 금나노입자 표면에 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터를 결합시키는 프로모터 결합 단계.

5

제4항에 있어서, 상기 항체 결합 단계는 금나노입자 및 엑소좀 표면 단백질 특이적 항체를 교반하여 수행되는 것인, 엑소좀 유래 miRNA 검출용 바이오센서의 제조 방법.

6

제4항에 있어서, 상기 프로모터 결합 단계는 프로모터 및 트리에틸렌 글라이콜 모노-11-머캅토운데실 에테르(Triethylene glycol mono-11-mercaptoundecyl ether)를 첨가하여 수행되는 것인, 엑소좀 유래 miRNA 검출용 바이오센서의 제조 방법.

7

금나노입자에 엑소좀 표면 단백질 특이적 항체, 및 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터가 결합된 엑소좀 유래 miRNA 검출용 바이오센서;상기 miRNA에 상보적이고 RNA 압타머를 코딩하는 제1 DNA 절편;상기 프로모터 및 miRNA에 상보적인 제2 DNA 절편;상기 제1 DNA 절편 및 제2 DNA 절편을 결합시키는 라이게이즈(Ligase); 및RNA 압타머를 생성하기 위한 RNA 중합효소;를 포함하는 엑소좀 유래 miRNA 검출용 조성물.

8

제7항에 있어서, 상기 miRNA가 miRNA-21인 경우, 제1 DNA 절편은 서열번호 3의 염기서열, 제2 DNA 절편은 서열번호 4의 염기서열로 표시되고, 상기 miRNA가 miRNA-U6인 경우, 제1 DNA 절편은 서열번호 7의 염기서열, 제2 DNA 절편은 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것인, 엑소좀 유래 miRNA 검출용 조성물.

9

다음 단계를 포함하는 엑소좀 유래 miRNA의 검출 방법:금나노입자 표면에 엑소좀 표면 단백질 특이적 항체 및 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터를 결합시키는 바이오센서 제조 단계;상기 바이오센서를 이용하여 시료로부터 엑소좀을 분리하는 엑소좀 분리 단계; 및상기 엑소좀 유래 miRNA를 증폭시키는 등온 핵산 증폭 단계.

10

제9항에 있어서, 상기 바이오센서 제조 단계는 다음 단계를 포함하는 것인, 엑소좀 유래 miRNA의 검출 방법:금나노입자 표면에 엑소좀 표면 단백질 특이적 항체를 결합시키는 항체 결합 단계; 및상기 금나노입자 표면에 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터를 결합시키는 프로모터 결합 단계.

11

제10항에 있어서, 상기 항체 결합 단계는 금나노입자 및 엑소좀 표면 단백질 특이적 항체를 교반하여 수행되는 것인, 엑소좀 유래 miRNA의 검출 방법.

12

제10항에 있어서, 상기 프로모터 결합 단계는 상기 프로모터 및 트리에틸렌 글라이콜 모노-11-머캅토운데실 에테르(Triethylene glycol mono-11-mercaptoundecyl ether)를 첨가하여 수행되는 것인, 엑소좀 유래 miRNA의 검출 방법.

13

제9항에 있어서, 상기 엑소좀 분리 단계는 시료에 상기 바이오센서를 투입 후 원심분리하여 수행되는 것인, 엑소좀 유래 miRNA의 검출 방법.

14

제9항에 있어서, 상기 등온 핵산 증폭 단계는 다음 단계를 포함하는 것인, 엑소좀 유래 miRNA의 검출 방법:상기 엑소좀 유래 miRNA를 신장(elongation)시키는 miRNA 신장 단계;상기 엑소좀 유래 miRNA를 증폭시키는 miRNA 증폭 단계; 및상기 miRNA에 상보적이고 RNA 압타머를 코딩하는 제1 DNA 절편, 상기 프로모터 및 상기 miRNA에 상보적인 제2 DNA 절편, 상기 제1 DNA 절편 및 제2 DNA 절편을 결합시키는 라이게이즈(Ligase), 및 RNA 압타머를 생성하기 위한 RNA 중합효소(polymerase)를 첨가하여 엑소좀 유래 miRNA에 대응하는 RNA 압타머를 생성하는 RNA 압타머 생성 단계.

15

제14항에 있어서, 상기 miRNA가 miRNA-21인 경우, 제1 DNA 절편은 서열번호 3의 염기서열, 제2 DNA 절편은 서열번호 4의 염기서열로 표시되고, 상기 miRNA가 miRNA-U6인 경우, 제1 DNA 절편은 서열번호 7의 염기서열, 제2 DNA 절편은 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것인, 엑소좀 유래 miRNA의 검출 방법.

16

제14항에 있어서, 상기 엑소좀 유래 miRNA의 검출 방법은 상기 RNA 압타머에 특이적인 형광 물질, 염료 및 방사선 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 표지 물질과의 반응 여부를 관찰하는 탐지 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 엑소좀 유래 miRNA의 검출 방법.