| 번호 | 청구항 |
|---|---|
| 56 | 제1항에 있어서, 상기 MSC의 배가시간(doubling time)은 35 내지 48시간인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 57 | 제1항에 있어서, 상기 MSC의 배가시간은 41 내지 45시간인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 55 | 제1항에 있어서, 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 15회의 계대를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 53 | 제1항에 있어서, 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 5회의 계대(passage)를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 1 | a) 인간 다능성 줄기세포(hPSC)를 생성시키는 단계;b) 상기 인간 다능성 줄기세포를 1일 내지 14일간 배양하여 배아체(EB)로 형성시키는 단계; 및c) 상기 배아체를 배양하여 중간엽 줄기세포(MSC)로 제조하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 제조방법으로서, 상기 c) 단계는 bFGF가 제외된 배지에서 EB를 배양한 후 TGF-β 저해제를 첨가하여 10일 내지 18일간 배양하는 단계; 고포도당 조건인 25mM의 농도의 포도당보다 낮은 저포도당 조건에서 상기 EB를 12일 내지 20일간 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법. |
| 2 | 제1항에 있어서, 상기 인간 다능성 줄기세포는 핵 이식 다능성 줄기세포(NT-hPSC), 반수성체-유래 다능성 줄기세포(pn-hPSC), 역분화 만능 줄기세포(iPSC), 또는 배아줄기세포(ESC)인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 3 | 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 동형접합 세포로부터 핵을 분리하여 핵 이식 인간 다능성 줄기세포(NT-hPSC)를 생성시키는 단계이며,a) 단계 전에 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 4 | 제3항에 있어서, 상기 스크리닝은 HLA(human leukocyte antigen)-A, HLA-B, HLA-DR의 유전자가 동형접합인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 5 | 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 핵 이식 인간 다능성 줄기세포(NT-hPSC)를 생성시키는 단계이며,상기 a)단계는, 난모세포의 핵을 제거하는 단계;하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계;포스트-활성화 배지에서 인큐베이션하여 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계;상기 활성화된 NT 난모세포로부터 배반포를 생성하는 단계; 및배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 ICM 세포는 NT-hPSC 세포로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 제조방법. |
| 6 | 제5항에 있어서, 상기 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 단백질 인산가수분해효소 저해제(protein phosphatase inhibitor)을 포함하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 7 | 제6항에 있어서, 상기 단백질 인산가수분해효소 저해제는 카페인인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 8 | 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 단계는 직접 주입을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 9 | 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 단계는 체세포 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 10 | 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵은 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)와 접촉된 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 11 | 제10항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자는 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질 및 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 12 | 제10항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자는 siRNA(small interfering RNA), 저분자, 단백질, 펩티드 또는 항체인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 13 | 제10항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자는 Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 Lin2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 14 | 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계는 센다이바이러스, 그의 단백질 또는 추출물을 포함하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 15 | 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포는 체세포 또는 생식세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 16 | 제5항에 있어서, 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계에서의 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 퓨로마이신(puromycin), 에탄올(ethanol), CHX(cycloheximide), TSA(trichostatin A), 및 CB(cytochalasin B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 17 | 제5항에 있어서, 상기 NT 난모세포는 후생학적 조절인자의 존재 하에서 배양된 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 18 | 제17항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자는 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질 및 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 19 | 제17항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자는 siRNA(small interfering RNA), 저분자, 단백질, 펩티드 또는 항체인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 20 | 제5항에 있어서, 상기 a) 단계는 자외선의 부재 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 21 | 제5항에 있어서, 상기 a) 단계는 난모세포로 정자 인자(sperm factors)를 주입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 22 | 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포(pn-hPSC)를 생성시키는 단계이며,상기 a) 단계는, 전기적 및/또는 화학적 자극을 가하여 난모세포를 활성화하는 단계;포스트-활성화 배지에서 상기 활성화된 난모세포를 인큐베이션하여 반수성체를 생성하는 단계;배양 배지에서 상기 반수성체를 인큐베이션하여 배반포를 형성하는 단계; 및 상기 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 내세포괴 세포는 pn-hPSC로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 54 | 제1항에 있어서, 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 10회의 계대를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 23 | 제22항에 있어서, 상기 난모세포를 활성화하는 단계에서의 화학적 자극은활성화 배지에서 인큐베이션하는 것이며, 상기 활성화 배지는 칼슘 이온운반체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 24 | 제23항에 있어서, 상기 칼슘 이온운반체는 이오노마이신, A23187, 부베리신(beauvericin), X-537A, 및 아베나시올리드(avenaciolide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 25 | 제22항에 있어서, 상기 반수성체를 생성하는 단계에서의 포스트-활성화 배지는 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계에서의 활성화 배지는 6-DMAP, 퓨로마이신(puromycin), 에탄올(ethanol), CHX(cycloheximide), TSA(trichostatin A), 및 CB(cytochalasin B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 26 | 제22항에 있어서, 상기 반수성체를 생성하는 단계에서의 포스트-활성화 배지는 제2극체 방출을 막지 않는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 27 | 제22항에 있어서, 상기 난모세포는 중기 II (MII) 단계 난모세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 28 | 제22항에 있어서, 상기 난모세포는 중기 I (MI) 단계 난모세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 29 | 제22항에 있어서, 상기 난모세포는 단일 전핵(pronuclear) 난모세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 30 | 제22항에 있어서, 상기 pn-hPSC는 이형접합(heterozygous)인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 31 | 제22항에 있어서, 상기 pn-hPSC는 동형접합(homozygous)인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 32 | 제22항에 있어서, 상기 pn-hPSC는 집단의 1% 이상과 면역적합성 인간 백혈구 항원 (HLA) 일배체형(haplotype)을 갖는 다능성 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 33 | 제32항에 있어서, 상기 HLA 일배체형은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 34 | 제22항에 있어서, 상기 a)단계는 난모세포로 정자 인자를 주입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 35 | 제22항에 있어서, 상기 난모세포는 CARM 1 및/또는 Esrrb의 존재 하에서 인큐베이션되는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 36 | 제1항에 있어서, 상기 b) 단계는 hPSC를 현탁 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 37 | 삭제 |
| 38 | 제36항에 있어서, 상기 b) 단계는 hPSC를 넉아웃 혈청 대체제(KSR, knockout-serum replacement)가 첨가된 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지에서 배양하여 EB로 형성시키는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 39 | 제36항에 있어서, 상기 b) 단계는 hPSC를 2개 이상의 군(clump)으로 분리한 후 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 40 | 삭제 |
| 41 | 삭제 |
| 42 | 삭제 |
| 43 | 제1항에 있어서, 상기 저포도당 조건의 배지에서 EB를 부착 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 44 | 제1항에 있어서, 상기 c)단계는,EB를 TGF-β 저해제 및 KSR이 보충된 DMEM/F12 배지에서 배양하는 단계; 및 혈청 및 항생제가 첨가된 저포도당 조건의 DMEM/F12 배지에서 상기 EB를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 45 | 제1항에 있어서, 상기 c)단계는,TGF-β 저해제가 첨가된 배지 및/또는 저포도당 조건의 배지에서 상기 EB를 배양하는 단계; 및상기 배지에서 배양된 EB의 결과물(outgrowth)을 MSC 증식 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 46 | 제1항에 있어서, 상기 c)단계는,EB를 TGF-β 저해제가 첨가된 배지에서 배양하는 단계;저포도당 조건의 배지에서 상기 EB를 배양하는 단계; 및상기 배지에서 배양된 EB의 결과물을 MSC 증식 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 47 | 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 MSC 증식 배지는 혈청, 항생제, 비필수 아미노산(NEAA) 및 β-머갑토에탄올(mercaptoethanol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 첨가된 DMEM 배지인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 48 | 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 EB의 결과물을 단일 세포로 분리하여 부착 배양 한 후 MSC 증식 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 49 | 제1항에 있어서, 상기 MSC의 80% 이상이 마커 CD29, CD44 및 CD90에 대하여 양성이며, 20% 이상이 마커 CD105에 대하여 양성인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 50 | 제1항에 있어서, 상기 MSC의 80% 이상이 마커 CD29, CD44, CD90 및 CD105에 대하여 양성인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 51 | 제1항에 있어서, 상기 MSC의 5% 미만이 마커 TRA1-60, SSEA4, CD34 및 CD45에 대하여 음성인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 52 | 제1항에 있어서, 상기 MSC의 3% 미만이 마커 TRA1-60, SSEA4, CD34 및 CD45에 대하여 음성인 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 58 | 제1항에 있어서, 상기 MSC는 조혈모세포, 근육세포, 심근세포, 간 세포, 연골세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포 및 뉴런 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 분화능을 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법. |
| 59 | 삭제 |
| 60 | 삭제 |
| 61 | 삭제 |
| 62 | 제1항에 있어서, d) 상기 제조된 중간엽 줄기세포(MSC)로부터 단일 세포를 분리하는 단계; 및 e) 상기 분리된 단일 세포를 배양하여 단일세포 유래 MSC를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법. |
| 63 | 제62항에 있어서, 상기 d) 단계의 중간엽 줄기세포는 P(Passage) 1 내지 P9의 세포인 것을 특징으로 하는 제조 방법. |
