ECM 단백질을 이용한 체외 폐 모델 제조 방법
A method for producing an in vitro lung model using extracellular matrix proteins
특허 요약
본 발명은 폐 유래 세포주를 이용하여 생체 폐의 조직학적 특징 및 기능적 특징을 모방하는 시험관 내 (in vitro) 폐 모델을 제조하는 방법에 관한 것으로, 트랜스웰 인서트 멤브레인에 세포외기질 단백질(라미닌, 및 콜라겐 또는 피브로넥틴)을 코팅한 후 폐 유래 세포를 배양하여 생체 폐 조직을 모방하는 시험관 내 폐 모델을 제조하였다. 이렇게 제조된 시험관 내 폐 모델은 세포 장벽의 기능이 잘 유지되어 있고 섬모 구조를 갖으며 고블릿 세포를 발현하고 면역 반응이 일어나는 등 생체 내 폐 조직의 특성을 잘 갖추고 있는 것을 확인하였다. 또한, 배양 시 이용하는 세포의 종류를 폐 질환 유래 세포로 변경함으로써 폐 질환을 앓고 있는 폐 조직을 모방하는 폐 질환 모델을 제조하는 것도 가능하였다. 이렇게 제조된 폐 질환 모델은 염증성 사이토카인 분비가 증가하는 것과 같이 폐 질환의 특성이 잘 나타나 이를 이용하면 폐 질환의 기전 연구 및 폐 질환 치료제의 스크리닝에 이용할 수 있을 것이다.
청구항
번호청구항
1
  1. 트랜스웰(transwell)의 인서트(insert) 멤브레인(membrane)을 세포외기질(extracellular matrix) 단백질로 코팅하는 단계;2) 트랜스웰의 인서트 멤브레인에 폐 유래 세포를 파종하는 단계; 및3) 배양 배지의 흐름을 유지하는 동적 배양으로 상기 세포를 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐 모방 시험관 내(in vitro) 폐 모델 제조 방법.
2

제1항에 있어서,상기 세포외기질 단백질은 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), 및 콜라겐(collagen)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 폐 모방 시험관 내(in vitro) 폐 모델 제조 방법.

3

제1항에 있어서,상기 폐 유래 세포는 폐 유래의 불멸화 세포주 또는 일차 세포인 것을 특징으로 하는 폐 모방 시험관 내(in vitro) 폐 모델 제조 방법.

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제3항에 있어서,상기 폐 유래의 불멸화 세포주는 A549 및 BEAS-2B로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 폐 모방 시험관 내(in vitro) 폐 모델 제조 방법.

5

제3항에 있어서,상기 일차 세포는 폐로부터 유래한 상피 세포 및 섬유아세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 폐 모방 시험관 내(in vitro) 폐 모델 제조 방법.

6

제1항에 있어서,상기 세포는 서로 상이한 종류의 세포를 2종 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 폐 모방 시험관 내(in vitro) 폐 모델 제조 방법.

7

제1항에 있어서,상기 배지의 흐름은 유속 0.1 μL/s 내지 1.0 μL/s인 것을 특징으로 하는 폐 모방 시험관 내(in vitro) 폐 모델 제조 방법.

8

제7항에 있어서,상기 배지의 흐름은 유속 0.3 μL/s 내지 0.7 μL/s인 것을 특징으로 하는 폐 모방 시험관 내(in vitro) 폐 모델 제조 방법.

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제1항의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 폐 모방 시험관 내(in vitro) 폐 모델 시스템.

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  1. 폐 질환 유래 상피 세포를 이용하여 제1항의 방법으로 제조된 폐 질환 시험관 내 모델을 제조하는 단계;2) 상기 단계 1)을 통해 제조된 폐 질환 시험관 내 모델에 피검물질을 처리하는 단계;3) 상기 단계 2)의 피검물질이 처리된 처리군 모델과 무처리된 대조군 모델을 비교하여 증상 회복 여부를 판단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐 질환 치료제 스크리닝 방법.
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제10항에 있어서, 상기 피검물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자 등으로부터 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폐 질환 치료제 스크리닝 방법.

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제10항에 있어서,상기 증상은 고블릿 세포의 발현 증가, 염증성 사이토카인의 발현 증가, 밀착연접 형성 감소, 및 세포층 두께 감소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 폐 질환 치료제 스크리닝 방법.

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제12항에 있어서,상기 염증성 사이토카인은 IP-10 및 IL6로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 폐 질환 치료제 스크리닝 방법.

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제10항에 있어서,상기 폐 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환인 것을 특징으로 하는 폐 질환 치료제 스크리닝 방법.