다음의 단계를 포함하는, 돌연변이가 도입된 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법:(1) 야생형의 타겟 유전자를 포함하는 벡터; 및 돌연변이가 도입된 타겟 유전자가 삽입될 베이스 벡터;를 준비하는 단계;(2) 상기 타겟 유전자의 일부 서열을 포함하는 뉴클레오티드 단편을 제작하는 단계로서, 상기 뉴클레오티드 단편은,i) 타겟 유전자의 일부 서열로서, 돌연변이가 도입되고, 5' 말단에 제1 제한효소 자리 및 3' 말단에 제2 제한효소 자리를 갖는 타겟 유전자 단편; ii) 임의의 서열을 갖는 임의의 단편; 및iii) 베이스 벡터로 삽입을 위한 제3 제한효소 자리;를 포함하는, 뉴클레오티드 단편을 제작하는 단계;(3) 5' 말단에 베이스 벡터로의 삽입을 위한 제4 제한효소 자리를 포함하는, 상기 타겟 유전자 단편의 5' 상류 부분을 합성하는 단계; (4) 3' 말단에 제3 제한효소 자리를 포함하는, 상기 타겟 유전자 단편의 3' 하류 부분을 합성하는 단계; (5) 상기 (1)의 베이스 벡터에 상기 (3)에서 합성된 타겟 유전자 단편의 5' 상류 부분을 삽입하는 단계;(6) 상기 (5)의 베이스 벡터에 상기 (2)에서 제작된 뉴클레오티드 단편을 삽입하는 단계; 및(7) 상기 (6)의 베이스 벡터에 상기 (4)에서 합성된 타겟 유전자 단편의 3' 하류 부분을 삽입하는 단계.

제1항에 있어서, 상기 베이스 벡터는 제4 제한효소 자리, 멀티플 클로닝 사이트(multiple cloning site) 및 제3 제한효소 자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 타겟 유전자 단편은 10 내지 500개 뉴클레오티드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 임의의 단편은 10 내지 100개 뉴클레오티드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (2) 단계에서 제작된 뉴클레오티드 단편은 5'부터 3'의 순서로 i), ii) 및 iii)이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 상기 돌연변이는 침묵 돌연변이(silent mutation), 넌센스 돌연변이(nonsense mutation), 미스센스 돌연변이(missense mutation), 염기의 삽입(insertion), 및 염기의 결실(deletion)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 제1 제한효소 자리 및 제2 제한효소 자리는 침묵 돌연변이(silent mutation)를 이용하여 도입된 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 제1 제한효소 자리는 상기 (2) 단계에서 제작된 뉴클레오티드 단편 및 상기 (3) 단계에서 합성된 상기 i)의 5' 상류 부분의 서열 내에서 유일한 제한효소 자리인 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 제2 제한효소 자리는 타겟 유전자 전체 서열 내에서 유일한 제한효소 자리인 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (2) 단계는, iv) 상기 ii)의 단편 및 iii)의 제3 제한효소 자리 사이에 제5 제한효소 자리 및 그로부터 이어지는 8 내지 12개 뉴클레오티드를 갖는 바코드 서열; 을 추가로 포함하여 제작하는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (3) 단계 또는 상기 (4) 단계의 합성은 PCR 방법에 의한 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (5) 단계는, 베이스 벡터, 상기 (3) 단계에서 합성된 5' 상류 부분, 제4 제한효소 자리에 결합하는 제한효소 및 제1 제한효소 자리에 결합하는 제한효소를 혼합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (6) 단계는, 상기 (5) 단계의 베이스 벡터, 상기 (2) 단계에서 제작된 뉴클레오티드 단편, 제1 제한효소 자리에 결합하는 제한효소 및 제3 제한효소 자리에 결합하는 제한효소를 혼합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (7) 단계는, 상기 (6) 단계의 베이스 벡터, 상기 (4) 단계에서 합성된 3' 하류 부분, 제2 제한효소 자리에 결합하는 제한효소 및 제3 제한효소 자리에 결합하는 제한효소를 혼합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 뉴클레오티드 단편이 상기 타겟 유전자의 첫 번째 염기서열을 포함하는 경우,상기 (3) 단계 및 (5) 단계는 포함하지 않고, 상기 (6) 단계의 '상기 (5)의 베이스 벡터'는 '상기 (1)의 베이스 벡터'인 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 뉴클레오티드 단편이 타겟 유전자의 마지막 염기서열을 포함하는 경우,상기 (4) 단계 및 (7) 단계는 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 단백질의 cDNA, genomic DNA 및 DNA 단편으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법.

제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 타겟 유전자의 핵산 서열 제작 방법을 복수 회 반복하여, 타겟 유전자에 대한 포화 돌연변이 라이브러리를 구축하는 방법으로서, 상기 방법은(A) 상기 제1항의 (2) 단계에서 제작되는 뉴클레오티드 단편이 개시코돈을 포함하는 것으로서 서로 다른 돌연변이를 갖는 cDNA 군;(B) 상기 제1항의 (2) 단계에서 제작되는 뉴클레오티드 단편이 개시코돈 및 종결코돈을 포함하지 않는 것으로서 서로 다른 돌연변이를 갖는 cDNA 군; 및(C) 상기 제1항의 (2) 단계에서 제작되는 뉴클레오티드 단편이 종결코돈을 포함하는 것으로서 서로 다른 돌연변이를 갖는 cDNA 군;을 제작하는 것인, 포화 돌연변이 라이브러리의 구축 방법.