FRET-PAINT를 이용한 폴리뉴클레오티드 검출방법
Method for detecting polynucleotide using FRET-PAINT
특허 요약
본 발명은 FRET-PAINT 방법을 사용하여 단일-분자 수준에서 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 검출 방법을 사용할 경우, 비특이적 결합과 off-target 결합 문제를 해결할 수 있으며, 1bp 미스매치(mismatch)에 불과한 폴리뉴클레오타이드도 구별할 수 있다.
청구항
번호청구항
18

적어도 2종 이상의 검출대상 miRNA를 검출 칩(chip)에 고정하는 단계;상기 적어도 2종 이상의 검출대상 miRNA 중 1종을 검출하기 위한, 제1항, 제3항 내지 제7항, 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 miRNA 검출용 조성물을 상기 검출 칩과 접촉시켜 발생하는 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 신호를 측정하는 단계;상기 검출 칩을 씻어내는 단계; 및상기 적어도 2종 이상의 검출대상 miRNA 중 또 다른 1종을 검출하기 위한, 제1항, 제3항 내지 제7항, 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 miRNA 검출용 조성물을 상기 검출 칩과 접촉시켜 발생하는 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 신호를 측정하는 단계를 포함하는, miRNA의 검출 방법.

1

검출대상 miRNA의 제 1 표적 핵산부위와 상보적인 핵산 서열을 포함하고 주개 (donor) 형광물질로 표지된 주개 핵산분자, 및상기 검출대상 miRNA의 제 2 표적 핵산부위와 상보적인 핵산 서열을 포함하고 받개(acceptor) 형광물질로 표지된 받개 핵산분자를 포함하며,상기 제 1 표적 핵산부위 및 상기 제 2 표적 핵산부위는 상기 검출대상 miRNA의 서로 다른 부위이고, 상기 제 1 표적 핵산부위 및 상기 제 2 표적 핵산부위의 간격은 3개 내지 5개인 뉴클레오타이드인,miRNA 검출용 조성물로서,상기 조성물은 상기 miRNA의 단일 염기 다형성 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP)을 검출 가능한 것인, 조성물.

2

삭제

3

제1항에 있어서, 서로 다른 2종 이상의 받개 핵산분자를 포함하는, 조성물.

4

제3항에 있어서, 상기 서로 다른 2종 이상의 받개 핵산분자는, 서로 다른 받개 형광물질로 표지된 것인, 조성물.

5

제1항에 있어서, 상기 받개 형광물질의 흡수 에너지 준위는, 상기 주개 형광물질의 방출 빛띠와 중첩되는, 조성물.

6

제1항에 있어서, 상기 주개 형광물질 및 상기 받개 형광물질은 Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 488, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5-Allophycocyanin, Cy7, 및 Alexa Fluor 790로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이며,상기 받개 형광물질의 흡수 에너지 준위는, 상기 주개 형광물질의 방출 빛띠와 중첩되는, 조성물.

7

제1항에 있어서, 상기 검출대상 miRNA는 말단에 폴리뉴클레오타이드 꼬리를 가져 검출 칩(chip)에 고정되는 것인, 조성물.

8

삭제

9

제1항에 있어서, 상기 주개 핵산분자 및 상기 받개 핵산분자는, 5 내지 15개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 것인, 조성물.

10

제1항에 있어서, 상기 제 1 표적 핵산부위 및 상기 제 2 표적 핵산부위는, 상기 검출 대상 miRNA 내의 연속하는 5 내지 15개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 조성물.

11

제3항에 있어서, 상기 받개 핵산분자를 서로 다른 2종 포함하고, 상기 제 1 표적 핵산부위 및 상기 제 2 표적 핵산부위는, 상기 검출 대상 miRNA 내의 연속하는 6 내지 8개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 조성물

12

제1항, 제3항 내지 제7항, 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 miRNA 검출용 조성물을 생물학적 시료와 접촉시켜 발생하는 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 신호를 측정하는 단계를 포함하는, miRNA의 검출 방법.

13

삭제

14

제12항에 있어서, 상기 검출 대상 miRNA는 말단에 폴리뉴클레오타이드 꼬리를 가져 검출 칩(chip)에 고정되는 것인, 방법.

15

제12항에 있어서, 상기 생물학적 시료는, 상기 검출 대상 miRNA와 염기 상동성이 90% 이상인 miRNA를 포함하는 것인, 방법.

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제12항에 있어서, 상기 생물학적 시료는, 검출 대상 miRNA를 포함하는, 분리된 세포, 세포 용해물, 세포 추출물, 세포 파쇄물, 분리된 DNA 또는 분리된 RNA인, 방법.

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제12항에 있어서, FRET 신호 측정결과 유효 시그널 이상의 sm-FRET 신호가 최소 검출 횟수 이상 검출될 경우, 상기 검출대상 miRNA인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하며,상기 유효 시그널 이상의 sm-FRET 신호는, 상기 검출 대상 miRNA가 아닌 임의의 miRNA에 대해, 상기 검출 대상 miRNA의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 임의의 주개 핵산분자 및 받개 핵산분자가 결합되었을 때 발생하는 sm-FRET 신호의 시그널 길이 중 최대값을 기준으로, 상기 최대값 이상의 길이를 가지는 sm-FRET 신호이며,상기 최소 검출 횟수는, 상기 검출 대상 miRNA가 아닌 임의의 miRNA에 대해, 상기 검출 대상 miRNA의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 임의의 주개 핵산분자 및 받개 핵산분자가 결합되었을 때 발생하는 상기 유효 시그널 이상의 sm-FRET 신호의 최대 출현 횟수인, 방법.

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제1항, 제3항 내지 제7항, 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 miRNA 검출용 조성물을 생물학적 시료와 접촉시켜 발생하는 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 신호를 측정하는 단계를 포함하는, miRNA의 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 검출 방법.