RISC를 이용한 폴리뉴클레오타이드의 검출방법
Method for detecting polynucleotide using RISC
특허 요약
본 발명은 폴리뉴클레오타이드의 검출 및 단일염기다형성을 단일 분자 수준에서 구분하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 핵산 분자와 아고너트(Argonaute) 단백질의 복합체를 이용해 small RNA를 검출, 정량 및 단일염기 다형성(SNP)을 단일분자 수준에서 구분할 수 있는 small RNA 검출 방법에 관한 것이다.
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아고너트(Argonaute) 단백질; 및 핵산 분자가 결합된 단백질-핵산 복합체를 포함하고,상기 핵산 분자는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지며,상기 핵산 분자는 형광물질로 표지된 것인, 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물로서, 하기 (1) 및 (2) 중 1종 이상의 특징을 가지는 것인, 조성물:(1) 상기 조성물은 서로 다른 2종 이상의 단백질-핵산 복합체를 포함하며, 상기 서로 다른 2종 이상의 단백질-핵산 복합체는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 서로 다른 2 이상의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 것임;(2) 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드는 서로 다른 2종 이상임.

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제7항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위는 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드 내의 연속하는 5 내지 15개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 조성물.

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아고너트 (Argonaute) 단백질; 및핵산 분자가 결합된 단백질-핵산 복합체를 포함하고,상기 핵산 분자는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지고, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 일부에 결합하는 것이며,상기 핵산 분자는 형광물질로 표지된 것인,폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물.

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제7항에 있어서, 상기 서로 다른 2종 이상의 단백질-핵산 복합체는, 서로 다른 2종 이상의 신호를 발생시키는 형광물질로 표지된 것인, 조성물.

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제7항에 있어서, 상기 핵산 분자는 링커를 포함하고, 상기 링커는 아민기를 포함하며, 상기 형광물질은 상기 링커의 아민기를 통해 상기 핵산 분자에 표지된 것인, 조성물.

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제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을, 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법.

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제13항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 및 miRNA로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.

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제13항에 있어서, 상기 생물학적 시료는, 분리된 세포, 세포 용해물, 세포 추출물, 세포 파쇄물, 또는 분리된 DNA 또는 RNA인, 폴리뉴클레오타이드 검출 방법.

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제7항의 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을, 생물학적 시료와 접촉시키는 단계;상기 접촉에 의해 발생하는 형광신호를 측정하는 단계; 및상기 측정된 형광신호를 이용하여 결합상태 시간분율 (time fraction)을 계산하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법.

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폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계;상기 접촉에 의해 발생하는 형광신호를 측정하는 단계; 및상기 측정된 형광신호를 이용하여 결합상태 시간분율 (time fraction)을 계산하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법으로서,상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물은 아고너트(Argonaute) 단백질; 및 핵산 분자가 결합된 단백질-핵산 복합체를 포함하고,상기 핵산 분자는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지며,상기 핵산 분자는 형광물질로 표지된 것이고,상기 방법을 적어도 2회 이상 수행하되, 각각의 수행은 서로 다른 단백질-핵산 복합체를 사용하여 수행되는 것이며,상기 서로 다른 단백질-핵산 복합체는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 서로 다른 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 것인, 방법.

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제10항의 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을, 생물학적 시료와 접촉시키는 단계;상기 접촉에 의해 발생하는 서로 다른 2종 이상의 형광신호를 측정하는 단계; 및상기 측정된 서로 다른 2종 이상의 형광신호를 이용하여 각각의 결합 상태 시간분율 (time fraction)을 계산하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법.

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제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,상기 계산된 결합상태 시간분율 (time fraction)이 임계값 이상일 경우, 상기 생물학적 시료는 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

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제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합상태 시간분율은 하기 [수학식 1]로 계산되는 것인, 방법:[수학식 1]결합상태 시간분율 (time fraction) = T / P(T: 형광 신호가 감지되는 총 시간,P: 검출 시간)

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제19항에 있어서, 상기 임계값은, 상기 검출하고자 하는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 임의의 핵산 분자에 의한 결합상태 시간분율 (time fraction) 중 최소값 이하인, 방법.

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제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와 염기 상동성이 90% 이상인 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 방법.

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제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광신호를 측정하는 단계는 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy; TIRF), 다초점 형광 현미경 (Confocal microscopy), Epi-형광 현미경 (Epi-fluorescence microscopy), HiLo 현미경 (HiLo microscopy), 및 라인 스캐닝 공초점 현미경 (Line-scanning confocal microscopy)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 측정하는 것인, 방법.

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제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드는 말단에 폴리뉴클레오타이드 꼬리를 가져 검출 칩 (chip)에 고정되는 것인, 방법.

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제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP)의 검출 방법.