알파코로나바이러스의 검출 및 정량 방법
METHOD FOR DETECTION AND QUANTIFICATION OF ALPHACORONAVIRUS
특허 요약
본 발명은 알파코로나바이러스의 검출 및 정량을 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 알파코로나바이러스의 검출 및 정량 방법에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트들은 알파코로나바이러스에서 보존된 유전체 부위인 RdRp, S 및 N 유전자 부위를 각각 단독으로, 또는 동시에 검출 및 정량할 수 있으며, TaqMan-기반 실시간 qPCR 방법에 최적화하였으므로, 이를 이용하면 유전체 검출의 속도, 민감도, 특이도, 정확도 및 신뢰도를 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
청구항
번호청구항
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  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는 세트;2) 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는 세트; 또는3) 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는 세트를 포함하는, 알파코로나바이러스(alphacoronavirus)의 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트.
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제 1항에 있어서, 알파코로나바이러스의 RdRp(RNA dependent RNA polymerase), S(spike) 또는 N(nucleocapsid) 유전자에 특이적으로 결합하는, 알파코로나바이러스의 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트.

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제 1항에 있어서, 프로브는 5' 말단에 형광물질이 표지되고, 3' 말단에 소광제(quencher)가 표지되는, 알파코로나바이러스의 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트.

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제 3항에 있어서, 형광물질은 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texas red), Cy3(Cyanine-3) 또는 Cy5(Cyanine-5)인, 알파코로나바이러스의 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트.

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제 3항에 있어서, 소광제는 BHQ1(Black hole quencher 1), BHQ2(Black hole quencher 2), BHQ3(Black hole quencher 3), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ(Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, MGB Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher) 또는 아이오와블랙(Iowa black)인, 알파코로나바이러스의 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트.

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제 1항에 있어서, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 PCR(consensus sequence primed PCR; CP-PCR), 임의적 프라이밍 PCR(arbitrarily primed PCR; AP-PCR), 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 PCR(multiplex PCR), 이중 PCR(nested-PCR), 단일 튜브 이중 PCR(single tube nested-PCR), 역전사-PCR(reverse transcription PCR; RT-PCR), 역 PCR(inverse PCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 및 실시간 정량적 PCR(real-time quantitative PCR; RQ-PCR), dPCR(Digital PCR) 또는 TaqMan 기반 실시간 정량 중합효소연쇄반응(TaqMan-based real-time qPCR)용인, 알파코로나바이러스의 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트.

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제 1항에 있어서, TaqMan 기반 실시간 정량 중합효소연쇄반응(TaqMan-based real-time qPCR)용인, 알파코로나바이러스의 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트.

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제 1항에 있어서, 알파코로나바이러스는 Colacovirus, Decacovirus, Duvinacovirus, Luchacovirus, Minacovirus, Minunacovirus, Myotacovirus, Nyctacovirus, Pedacovirus, Rhinacovirus, Setracovirus, Soracovirus, Sunacovirus 또는 Tegacovirus인, 알파코로나바이러스의 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트.

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제 1항에 있어서, 알파코로나바이러스는 Lucheng Rn CoV(LRNV), AcCoV-JC34, RtRl-CoV, RtMruf-CoV, HCoV KUMC22-3, AaCoV인, 알파코로나바이러스의 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트.

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  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는 세트;2) 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는 세트; 또는3) 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 세트를 포함하는, 알파코로나바이러스의 다중 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트.
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제 10항에 있어서, 알파코로나바이러스의 RdRp, S 및 N 유전자를 동시에 검출 또는 정량하는, 알파코로나바이러스의 다중 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트.

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제 1항의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 알파코로나바이러스의 검출용 조성물.

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제 10항의 다중 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 알파코로나바이러스의 RdRp, S 및 N 유전자의 동시 검출용 조성물.

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제 1항의 프라이머 및 프로브 세트, 또는 제 10항의 다중 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 알파코로나바이러스 감염 진단용 조성물.

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제 1항의 프라이머 및 프로브 세트, 또는 제 10항의 다중 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트; 및 TaqMan 기반 실시간 정량 중합효소연쇄반응에 필요한 시약을 포함하는, 알파코로나바이러스 검출 또는 감염 진단 키트.

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제 15항에 있어서, TaqMan 기반 실시간 정량 중합효소연쇄반응에 필요한 시약은 dUTP를 포함한 dNTP, DNA 중합효소, UNG(uracil-N glycosylase) 및 완충액인, 알파코로나바이러스 검출 또는 감염 진단 키트.

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(a) 검체에서 핵산을 추출하는 단계; 및(b) 제 1항의 프라이머 및 프로브 세트, 또는 제 10항의 다중 검출 또는 정량용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응-기반 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 알파코로나바이러스 검출 또는 정량 방법.