광게이트 단백질 절단 효소를 이용한 광스위치
photoswitches via light-gated proteases
특허 요약
본 발명은 청색광을 입력 신호로 사용하여 원격으로 세포를 제어할 수 있는 분자 스위치에 관한 것으로, 본 발명의 융합 단백질은 특정 파장의 빛에 의해 자가 단백질 절단이 유도되며, 보편적 유전자 조작 방법을 사용하며 다른 유사한 종류의 단백절단효소를 이용한 유사체 개발이 가능하고, 모듈 방식으로 연결되는 분비 모듈을 다양한 모듈로 교체 가능하며, 단일 단백체 사슬로 구성되어 다른 합성 생물학 시스템에 이식이 용이하므로, 세포를 제어할 수 있는 분자 스위치와 같은 세포 내 다양한 활용이 가능한 플랫폼으로 이용할 수 있다.
청구항
번호청구항
1

(1) 펩타이드를 고정시키기 위한 앵커링(anchoring) 모듈;(2) 광조사에 의하여 분비 모듈 내의 페이로드(payload)의 방출을 조절하기 위한 광 제어 모듈; 및(3) 광조사에 의하여 자가 절단되어 페이로드를 방출하는 분비 모듈을 포함하는 융합 단백질로서,1) 앵커링 모듈은 세포 소기관 또는 세포막에 앵커링할 수 있는 도메인을 포함하는 제 1 펩타이드를 포함하며; 2) 광 제어 모듈은a) 광에 반응하여 이합체를 형성하여 단백질 절단 효소 활성을 갖는 제 2 펩타이드 및 제 3 펩타이드를 포함하고, 제 2 펩타이드는 광 조절 모듈 내에서 N-말단에서 C-말단 방향을 기준으로 제 3 펩타이드의 전단에 위치하며,b) 제 2 펩타이드 및 제 3 펩타이드는 단백질 절단 효소의 절편이고, 제 2 펩타이드는 단백질 절단 효소의 N-말단에서 C-말단 방향을 기준으로 후단에 위치한 절편이며, 제 3 펩타이드는 전단에 위치한 절편이고; 및3) 분비 모듈은 a) 제 2 펩타이드 및 제 3 펩타이드가 광에 의하여 단백질 절단 효소 활성을 갖는 경우 절단되는 표적 절단 서열을 포함하며,b) 표적 절단 서열이 절단되는 경우, 페이로드가 방출되며,c) 상기 페이로드는 이펙터 모듈을 포함하며,d) 상기 이펙터 모듈은 rtTA(reverse tetracycline-controlled transactivator)를 포함하는; 융합 단백질.

2

제 1항에 있어서, 제 1 펩타이드는 세포 또는 세포소기관 표적화 서열을 포함하는, 융합 단백질.

3

제 1항에 있어서, 단백질 절단 효소는 TEV 단백질 절단 효소(tobacco etch virus protease, TEVp), SbMV 단백질 절단 효소(Soybean Mosaic Virus protease, SbMVp) 또는 TVMV 단백질 절단 효소(Tobacco Vein Mottling Virus protease, TVMVp)인, 융합 단백질.

4

제 1항에 있어서, 광 제어 모듈은 제 2 펩타이드 및 제 3 펩타이드가 광에 의하여 이합체를 형성하여 단백질 절단 효소 활성을 갖도록 하는 iLID(improved light-induced dimer)를 추가로 포함하는 것인, 융합 단백질.

5

제 1항에 있어서, 광 제어 모듈은 핵외수송서열(nuclear export seqeunce, NES)을 추가로 포함하는 융합 단백질.

6

제 1항에 있어서, 광 제어 모듈은 제 2 펩타이드, 링커, iLID, NES, 제 3 펩타이드 및 iLID를 순차적으로 포함하는 융합 단백질.

7

제 6항에 있어서, 핵외수송서열을 2번 반복하여 포함하는, 융합 단백질.

8

제 6항에 있어서, 링커는 43개의 아미노산으로 이루어진, 융합 단백질.

9

삭제

10

삭제

11

제 1항에 있어서, 융합 단백질은 광조사에 의해 자가 절단되어 이펙터 모듈을 포함하는 페이로드를 방출하며, 테트라사이클린 유사체에 의해 이펙터 모듈 내의 표적 유전자의 발현이 제어되는, 융합 단백질.

12

제 1항에 있어서, 이펙터 모듈은 rtTA의 TetR, FKBP, 단백질 절단 효소의 표적 절단 서열, 단백질 절단 효소, 단백질 절단 효소의 표적 절단 서열, FRB 및 rtTA의 VP16를 순차적으로 포함하는 것인, 융합 단백질.

13

제 12항에 있어서, 융합 단백질은 광조사에 의하여 자가 절단되어 이펙터 모듈을 포함하는 페이로드를 방출하며, 라파마이신 유사체에 의하여 이펙터 모듈 내의 표적 유전자의 발현이 제어되는, 융합 단백질.

14

제 1항의 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 벡터.

15

앵커링 모듈, 제 1 광 제어 모듈 및 제 1 분비 모듈을 포함하는 제 1 융합 단백질; 및제 2 광 제어 모듈 및 제 2 분비 모듈을 포함하는 제 2 융합 단백질을 포함하는, 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트로서, 1) 제 1 광 제어 모듈은: a) 광에 반응하여 이합체를 형성하여 단백질 절단 효소 활성을 갖는 제 2 펩타이드 및 제 3 펩타이드를 포함하고, 제 2 펩타이드는 광 조절 모듈 내에서 N-말단에서 C-말단 방향을 기준으로 제 3 펩타이드의 전단에 위치하며,b) 제 2 펩타이드 및 제 3 펩타이드는 단백질 절단 효소의 절편이고, 제 2 펩타이드는 단백질 절단 효소의 N-말단에서 C-말단 방향을 기준으로 후단에 위치한 절편이며, 제 3 펩타이드는 전단에 위치한 절편이고; 2) 제 2 광 제어 모듈은 DRD2, 제 3 펩타이드 및 iLID를 포함하며;3) 제 1 분비 모듈은 단백질 절단 효소의 표적 절단 서열, 이펙터 모듈(effector module)을 포함하고; 및4) 제 2 분비 모듈은:a) 단백질 절단 효소의 표적 절단 서열 및 페이로드를 포함하며,b) 상기 페이로드는 이펙터 모듈을 추가로 포함하는; 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트.

16

제 15항에 있어서, 제 1 분비 모듈의 이펙터 모듈은 βArr2 및 제 2 펩타이드를 포함하는, 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트.

17

제 15항에 있어서, 광조사에 의해 제 1 융합 단백질이 자가 절단되어 이펙터 모듈을 방출하고, 및 GPCR 리간드에 의해 제 2 융합 단백질이 자가 절단되어 페이로드가 방출되어 유전자의 발현이 제어되는, 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트.

18

삭제

19

제 15항에 있어서, 제 2 분비 모듈의 이펙터 모듈은 TetR 및 FKBP를 포함하는, 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트.

20

제 15항에 있어서, 앵커링 모듈 및 페이로드를 포함하는 제 3 융합 단백질을 추가로 포함하는, 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트.

21

제 20항에 있어서, 페이로드는 FRB 및 VP16를 포함하는, 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트.

22

앵커링 모듈, 제 1 광 제어 모듈 및 제 1 분비 모듈을 포함하는 제 1 융합 단백질을 암호화하는 제 1 플라스미드 벡터; 및제 2 광 제어 모듈 및 제 2 분비 모듈을 포함하는 제 2 융합 단백질을 암호화하는 제 2 플라스미드 벡터를 포함하는, 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트로서, 1) 제 1 광 제어 모듈은: a) 광에 반응하여 이합체를 형성하여 단백질 절단 효소 활성을 갖는 제 2 펩타이드 및 제 3 펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 포함하고, 제 2 펩타이드는 광 조절 모듈 내에서 N-말단에서 C-말단 방향을 기준으로 제 3 펩타이드의 전단에 위치하며,b) 제 2 펩타이드 및 제 3 펩타이드는 단백질 절단 효소의 절편이고, 제 2 펩타이드는 단백질 절단 효소의 N-말단에서 C-말단 방향을 기준으로 후단에 위치한 절편이며, 제 3 펩타이드는 전단에 위치한 절편이고; 2) 제 2 광 제어 모듈은 DRD2, 제 3 펩타이드 및 iLID를 암호화하는 핵산서열을 포함하며;3) 제 1 분비 모듈은 단백질 절단 효소의 표적 절단 서열, 이펙터 모듈(effector module)을 암호화하는 핵산서열을 포함하고; 및4) 제 2 분비 모듈은:a) 단백질 절단 효소의 표적 절단 서열 및 페이로드를 암호화하는 핵산서열을 포함하며,b) 상기 페이로드는 이펙터 모듈을 추가로 포함하는; 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트.

23

제 22항에 있어서, 제 1 분비 모듈의 이펙터 모듈은 βArr2 및 제 2 펩타이드를 포함하는, 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트.

24

삭제

25

제 22항에 있어서, 제 2 분비 모듈의 이펙터 모듈은 TetR 및 FKBP를 포함하는, 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트.

26

제 22항에 있어서, 앵커링 모듈 및 페이로드를 포함하는 제 3 융합 단백질을 암호화하는 제 3 플라스미드 벡터를 추가로 포함하는, 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트.

27

제 26항에 있어서, 페이로드는 FRB 및 VP16를 포함하는, 유전자 발현 또는 단백질 활성 제어 키트.