식중독균 검출용 프로브, 프로브 세트 및 이를 이용한 식중독균의 검출방법
Probe, Probe Set For Food Borne Pathogens And The Detecting Method Thereof
특허 요약
본 발명은 식중독균 검출용 프로브, 프로브 세트 및 이를 이용한 식중독균의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 식중독균의 존재를 검출하는 방법은 본 발명에 의한 식중독균 검출용 프로브를 사용하여 MLPA 방법에 의하여 프로브 어셈블리를 증폭하고, 증폭 산물에 대해 CE-SSCP (Capillary Electrophoresis-Single Strand Conformation Polymorphism)를 이용하여 분리 검출하는 것으로 구성되어, 각각의 프로브가 검출하고자 하는 식중독균에 대해 하나의 피크만을 나타내는 특이성이 있으므로 검출이 정확할 뿐만 아니라, 식중독균 감염 여부 및 감염균을 확인하고자 할 경우 복수의 식중독균에 대해 동시에 신속하고 정확하며 효과적으로 검출 및 동정이 가능하게 된다.
청구항
번호청구항
1

정방향 프라이머 결합 영역, 및 표적 서열의 제 1 영역에 특이적으로 혼성화하는 LHS(left hybridization sequence) 영역을 포함하는 LHO(left hybridization oligonucleotide) 프로브; 및 상기 표적 서열의 상기 제 1 영역과 연속으로 연결된 제 2 영역에 특이적으로 혼성화하는 RHS(right hybridization sequence) 및 역방향 프라이머 결합 영역을 포함하는 RHO(right hybridization oligonucleotide) 프로브;로 구성되고,상기 LHO(left hybridization oligonucleotide)의 LHS(left hybridization sequence) 및 상기 RHO(right hybridization oligonucleotide)의 RHS(right hybridization sequence)가 서열 번호 1 인 LHO 프로브 및 서열 번호 2 인 RHO 프로브로 구성되는 제 1 프로브, 서열 번호 3 및 서열 번호 4 인 제 2 프로브, 서열 번호 5 및 서열 번호 6 인 제 3 프로브, 서열 번호 7 및 서열 번호 8 인 제 4 프로브, 서열 번호 9 및 서열 번호 10 인 제 5 프로브, 서열 번호 11 및 서열 번호 12 인 제 6 프로브, 서열 번호 13 및 서열 번호 14 인 제 7 프로브, 서열 번호 15 및 서열 번호 16 인 제 8 프로브, 서열 번호 17 및 서열 번호 18 인 제 9 프로브, 및 서열 번호 19 및 서열 번호 20인 제 10 프로브를 포함하는 식중독균 검출용 조성물.

2

제 1 항에 있어서,상기 LHO(left hybridization oligonucleotide)의 LHS(left hybridization sequence) 및 상기 RHO(right hybridization oligonucleotide)의 RHS(right hybridization sequence)가 서열 번호 1 및 서열 번호 2 인 상기 제 1 프로브는 Vibrio parahaemolyticus 의 서열 번호 21 에 특이적으로 혼성 결합하고,서열 번호 3 및 서열 번호 4 인 상기 제 2 프로브는 Staphylococcus aureus 의 서열 번호 22 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열 번호 5 및 서열 번호 6 인 상기 제 3 프로브는 Listeria monocytogenes의 서열 번호 23 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열 번호 7 및 서열 번호 8 인 상기 제 4 프로브는 Campylobacter jejuni 의 서열 번호 24 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열 번호 9 및 서열 번호 10 인 상기 제 5 프로브는 Salmonella enteritidis 의 서열 번호 25에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열 번호 11 및 서열 번호 12 인 상기 제 6 프로브는 E.coli O157:H7의 서열 번호 26 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열 번호 13 및 서열 번호 14 인 상기 제 7 프로브는 Bacillus cereus 의 서열 번호 27 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열 번호 15 및 서열 번호 16 인 상기 제 8 프로브는 Shigella spp. 의 서열 번호 28 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열 번호 17 및 서열 번호 18 인 상기 제 9 프로브는 Clostridium perfringens 의 서열 번호 29 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열 번호 19 및 서열 번호 20 인 상기 제 10 프로브는 Yersinia enterocolytica 의 서열 번호 30에 특이적으로 혼성 결합하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 조성물.

3

삭제

4

시료를 제 1항의 식중독균 검출용 조성물과 접촉시켜 혼성화시키는 제 1 단계; 상기 LHO 프로브 및 RHO 프로브를 라이게이션하여 프로브 어셈블리를 형성시키는 제 2 단계; 상기 형성된 프로브 어셈블리를 주형으로 하여 PCR 증폭시키는 제 3 단계; 상기 증폭 산물을 분리, 검출하는 제 4 단계; 및 상기 증폭 산물이 분리, 검출되는 경우 상기 시료 내에 상기 증폭된 프로브 어셈블리를 구성하는 프로브가 상보적으로 결합하는 식중독균이 존재하는 것으로 판단하는 제 5 단계를 포함하는 식중독균의 존재를 검출하는 방법.

5

제 4항에 있어서, 상기 시료를 식중독균 검출용 조성물과 접촉시켜 혼성화시키는 제 1 단계에서는 상기 시료의 표적 서열 제 1 영역과 상기 LHO 프로브의 LHS가 혼성화되고, 상기 시료의 표적 서열 제 2 영역과 상기 RHO 프로브의 RHS 가 혼성화되는 것을 특징으로 하는 식중독균의 존재를 검출하는 방법.

6

제 4항에 있어서, 상기 LHO 프로브 및 RHO 프로브를 라이게이션하여 프로브 어셈블리를 형성시키는 제 2 단계에서는 상기 시료의 제 1 영역과 혼성 결합된 LHO의 LHS 말단과 상기 시료의 제 2 영역과 혼성 결합된 RHO 의 RHS 의 말단을 라이게이션하여 정방향 프라이머 결합 영역-LHO-RHO-역방향 프라이머 결합 영역으로 구성된 프로브 어셈블리를 형성하는 것을 특징으로 하는 식중독균의 존재를 검출하는 방법.

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제 4 항에 있어서,상기 형성된 프로브 어셈블리를 주형으로 하여 PCR 증폭시키는 단계에서는 상기 프로브 어셈블리를 구성하는 LHO(left hybridization oligonucleotide)가 포함하는 정방향 프라이머 결합 영역, 및 RHO(right hybridization oligonucleotide)가 포함하는 역방향 프라이머 결합 영역에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍을 사용하여 상기 프로브 어셈블리가 PCR 증폭되는 것을 특징으로 하는 식중독균의 존재를 검출하는 방법.

8

제 4 항에 있어서,상기 증폭된 프로브 어셈블리를 분리 검출하는 단계에서는 상기 프로브 어셈블리를 주형으로 하여 증폭된 정도를 CE-SSCP(Capillary Electrophoresis-Single strand conformation polymorphism)를 이용하여 분리 검출하는 것을 특징으로 하는 식중독균의 존재를 검출하는 방법.

9

제 4항에 있어서, 상기 제 1 단계에서는 상기 제 1항에 의한 식중독균 검출용 조성물을 사용하여 복수의 식중독균의 존재를 한번에 검출하는 것을 특징으로 하는 식중독균의 존재를 검출하는 방법.