면역증강제를 함유한 항원 백신 전달체의 등온 증폭 기반 제조방법
Isothermal amplification-based manufacturing method of antigen vaccine carrier containing an immunogenic adjuvant
특허 요약
본 발명은 대량의 면역증강제를 함유할 수 있는 항원 백신 전달체의 등온 증폭 기반 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조한 항원 백신 전달체에 대한 것이다. 본 발명은 등온 핵산 증폭 반응을 통해 면역증강제를 대량으로 합성함과 동시에 크기 조절이 가능한 핵산 입자를 형성할 수 있으며, 핵산 증폭 반응 혼합액에 단순히 항원을 첨가하는 것으로 핵산 입자에 단백질 항원 캡슐화가 가능할 수 있다. 즉, 본 발명은 단일 반응을 통해 in situ 방식으로 항원 단백질과 다량의 면역증강제를 동시에 함유한 백신 전달체를 대량으로 제작할 수 있다. 또한, 본 발명의 항원 백신 전달체는 생분해 가능한 생체적합 물질이며, 면역증강제 이외에 다른 기능성 핵산 도입에도 적용될 수 있다.
청구항
번호청구항
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제1항에 있어서, 상기 단계 i) 의 면역증강제는 CpG(cytosine-guanosine), 폴리(I:C)(Polyinosinic:polycytidylic acid), 이미다조퀴놀린(Imidazoquinolines) 및 록소리빈(Loxoribine) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.

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i) PEG(polyethylene glycol)를 포함하는 양친매성 고분자에 면역증강제 증폭용 프라이머(primer)를 결합하여 PEG-프라이머를 제조하는 단계;ii) 상기 제조한 PEG-프라이머를 완충용액에서 자가조립시켜 PEG화된 나노입자(nanoparticle, NP)를 형성하는 단계; iii) 상기 제조된 PEG화된 NP 및 면역증강제 서열의 상보적인 서열이 포함된 원형 주형(template)을 혼성화하는 단계; iv) 상기 혼성화한 PEG화된 NP 및 면역증강제 서열의 상보적인 서열이 포함된 원형 주형을 항원, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 반응 혼합액과 혼합하여 2565℃ 에서 4100 시간동안 등온 RCA(Isothermal rolling circle amplification) 반응시켜 항원 백신 전달체를 제조하는 단계; v) 상기 반응한 반응 혼합액을 원심분리하여 항원 백신 전달체를 분리하는 단계; 를 포함하는 항원 백신 전달체의 제조방법.

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제1항에 있어서, 상기 단계 i) 의 PEG를 포함하는 양친매성 고분자는 DBCO(Dibenzocyclooctyne), 1차 아민(-NH2), 카르복실산(-COOH), 설피드릴(-SH), 하이드록실(-OH), 아자이드(-N3), 알카인(-C≡C-) 및 비오틴(biotin)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 치환된 것을 특징으로 하는 제조방법.

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제1항에 있어서, 상기 단계 i) 의 PEG를 포함하는 양친매성 고분자는 PEG 및 비극성(hydrophobic) 생분해성 고분자로 이루어진 블록 공중합체인 것을 특징으로 하는 제조방법.

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제3항에 있어서, 상기 비극성 생분해성 고분자는 PLA(poly-DL-lactic acid), PHA(polyhydroxyalkanoates), PCL(polycaprolactone), PBAT(polybutylene adipate terephthalate), PGA(polyglycolic acid), PLGA(Poly(lactic-co-glycolic acid) 및 PU(Polyurethane) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.

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제1항에 있어서, 상기 단계 i) 의 면역증강제 증폭용 프라이머는 DBCO(Dibenzocyclooctyne), 1차 아민(-NH2), 카르복실산(-COOH), 설피드릴(-SH), 하이드록실(-OH), 아자이드(-N3), 알카인(-C≡C-) 및 비오틴(biotin)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 치환된 것을 특징으로 하는 제조방법.

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제1항에 있어서, 상기 단계 i) 의 PEG-프라이머는 SPAAC(Strain-promoted azide-alkyne click chemistry) 반응, EDC/NHS(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide) 반응, 말레이미드-티올 커플링(maleimide-thiol coupling) 반응, 구리 촉매 아지드-알킨 고리 첨가(Cu-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition, CuAAC) 클릭 반응, 비오틴-스트렙타비딘(biotin-streptavidin) 결합 반응으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

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제1항에 있어서, 상기 단계 iv) 의 DNA 중합효소는 phi29 DNA 중합효소, Bst DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, 클레노우 단편(Klenow fragment) DNA 중합효소, 벤트(Vent) DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.

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제1항의 제조방법으로 제조된 항원 백신 전달체.

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제9항의 항원 백신 전달체를 포함하는 백신 조성물.