혈관 신생 촉진용 조성물 및 이의 제조 방법
COMPOSITION FOR PROMOTING ANGIOGENESIS AND METHOD FOR PRODUCING THEREOF
특허 요약
본 명세서에서는 줄기세포로부터 분화된 내피세포와 HA-CA 하이드로겔을 포함하는, 혈관 신생 촉진용 조성물과 이의 제조 방법이 제공된다. 또한, 본 명세서에서는 본 발명이 제공하는 혈관 신생 촉진용 조성물을 포함한, 심혈관계 질환에 대하여 예방 또는 치료 효과를 갖는 세포 치료제 조성물이 제공된다.
청구항
번호청구항
1

줄기세포로부터 분화된 내피세포 및 HA-CA (catechol-modified hyaluronic acid) 하이드로겔 (hydrogel)을 포함하고,상기 줄기세포는,인간 만능줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포이고,상기 내피세포는,CDH5(Cadherin 5)를 발현하는 내피세포를 98 % 이상 함유하고,산화제 및 pH 조절제를 더 포함하고,상기 산화제는,과요오드산나트륨 (sodium periodate), 과산화수소 (hydrogen peroxide), 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase), 및 타이로시나아제 (tyrosinase)로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함하고,상기 산화제의 농도는,3 내지 5 mg/ml이고,상기 pH 조절제는,수산화나트륨 (sodium hydroxide), 수산화리튬 (lithium hydroxide), 수산화칼륨 (potassium hydroxide), 수산화루비듐 (rubidium hydroxide), 수산화세슘 (cesium hydroxide), 수산화마그네슘 (magnesium hydroxide), 수산화칼슘 (calcium hydroxide), 수산화스트론튬 (strontium hydroxide) 및 수산화바륨 (barium hydroxide)으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함하고,상기 HA-CA는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인, 혈관 신생 촉진용 조성물.[화학식 1]상기 식에서, n은 2 내지 700의 정수이고, m은 n보다 작으며 1 내지 300의 정수이다.

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제 1항에 있어서,상기 HA-CA는, HA (hyluronic acid)의 카르복실기(carboxy group)가 도파민 (dopamine)의 아민기(amine group)와 아마이드 결합으로 결합되어 형성된, 혈관 신생 촉진용 조성물.

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제 1항에 있어서, 상기 내피세포의 CDH5 mRNA의 발현 수준은,미분화된 줄기세포 또는 중배엽적으로 분화된 줄기세포 (mesodermally-differentiated stem cell) 보다 10배 높은, 혈관 신생 촉진용 조성물.

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제 1항에 있어서,상기 내피세포는,상기 HA-CA 하이드로겔에 의해 캡슐화되고 (encapsulated),상기 내피세포의 생체 내 (in vivo) 생존률은,상기 HA-CA 하이드로겔에 의해 캡슐화되지 않은 내피세포보다 10배 내지 15배 높은, 혈관 신생 촉진용 조성물.

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제 1항에 있어서,상기 내피세포의 함량은,상기 조성물의 총 부피에 대하여 75 부피 % 내지 90 부피 %인, 혈관 신생 촉진용 조성물.

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제 1항에 있어서,상기 내피세포의 농도는,1 X 105 CFU/ml 내지 6 X 106 CFU/ml인, 혈관 신생 촉진용 조성물.

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제 1항에 있어서,상기 HA-CA 하이드로겔의 함량은,상기 조성물의 총 부피에 대하여, 1 부피 % 내지 5 부피 %인, 혈관 신생 촉진용 조성물.

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제 1항에 있어서,상기 조성물은,근육 내 주사, 정맥 주사, 피하 주사, 피내 주사, 기관 내 및 피부 국소 도포 중 적어도 하나의 방법으로 투여되는 형태인, 혈관 신생 촉진용 조성물.

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줄기세포로부터 내피세포 계통 세포로 분화하도록 배양하는 단계;분화된 상기 내피세포 계통 세포들 중에 CDH5(Cadherin 5)유전자의 발현 수준이 미리 결정된 수준 이상인 동질성의 내피세포를 선별(sorting)하는 단계;상기 동질성의 내피세포 현탁액에 HA-CA 하이드로겔을 혼합하는 단계를 포함하고,산화제 및 pH 조절제를 혼합하는 단계를 더 포함하고,상기 미리 결정된 수준은,98 %이고,상기 산화제는,과요오드산나트륨 (sodium periodate), 과산화수소 (hydrogen peroxide), 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase), 및 타이로시나아제 (tyrosinase)로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함하고,상기 산화제의 농도는,3 내지 5 mg/ml이고,상기 pH 조절제는,수산화나트륨 (sodium hydroxide), 수산화리튬 (lithium hydroxide), 수산화칼륨 (potassium hydroxide), 수산화루비듐 (rubidium hydroxide), 수산화세슘 (cesium hydroxide), 수산화마그네슘 (magnesium hydroxide), 수산화칼슘 (calcium hydroxide), 수산화스트론튬 (strontium hydroxide) 및 수산화바륨 (barium hydroxide)으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함하고,상기 HA-CA는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인, 혈관 신생 촉진용 조성물의 제조 방법.[화학식 1]상기 식에서, n은 2 내지 700의 정수이고, m은 n보다 작으며 1 내지 300의 정수이다.

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제 15항에 있어서, 상기 배양하는 단계는,상기 줄기세포를 중배엽 계통 세포로 분화하도록 배양하는 단계, 및상기 중배엽 계통 세포를 내피세포 계통 세포로 분화하도록 배양하는 단계를 포함하는, 혈관 신생 촉진용 조성물의 제조 방법.

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제 16항에 있어서,상기 내피세포 계통 세포로 분화하도록 배양하는 단계는,DLL4(Delta Like Canonical Notch Ligand 4)를 처리한 배지에서 상기 중배엽 계통 세포를 배양함으로써, 상기 내피세포 계통 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 혈관 신생 촉진용 조성물의 제조 방법.

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제 15항에 있어서,상기 HA-CA 하이드로겔을 처리하는 단계는,2 내지 7일 중 하나의 기간 동안 수행되는, 혈관 신생 촉진용 조성물의 제조 방법.

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제 15항에 있어서,상기 HA-CA 하이드로겔을 혼합하는 단계 이후에, 산화제 및 pH 조절제를 혼합하는 단계를 더 포함하는, 혈관 신생 촉진용 조성물의 제조 방법.

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제 1항, 제 5항, 제 9항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 기재된 혈관 신생 촉진용 조성물을 포함하는, 심혈관계 질환의 예방용 또는 치료용 세포 치료제 조성물.

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제 20항에 있어서,상기 심혈관계 질환은,혈전증, 말초동맥질환, 허혈성 심장질환, 협심증, 뇌혈관질환, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색증, 동맥경화증, 부정맥 고혈압, 및 당뇨병성 혈관 질환으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함하는, 심혈관계 질환의 예방용 또는 치료용 세포 치료제 조성물.