압타머로 수식된 헤어핀 프로브를 활용한 LAMP 반응 기반 전기화학적 등온 표적핵산 검출방법
Method for Electrochemical and Isothermal Detection of Nucleic Acid based on Loop-mediated Amplification utilizing Aptamer-Modified Hairpin Probe(LAMP-AMP)
특허 요약
본 발명은 표적핵산에 의해 유도된 LAMP 반응의 증폭산물의 염기서열 일부와 상보적인 서열을 갖는 루프 부위와, 전기화학적 신호를 발생시키는 신호물질에 특이적으로 결합하는 압타머 염기서열이 수식된 스템 부위를 갖는 헤어핀 프로브를 이용한 전기화학적 등온 표적핵산 검출방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 전기화학적 등온 표적핵산 검출방법은 형광 및 전기화학 물질의 표지 없이 수행할 수 있어 가격이 저렴하고, 상대적으로 소형화가 용이한 분석장비로 수행할 수 있어 다양한 감염성 질환 현장진단에 적용될 수 있으며, 기존의 LAMP 기술의 비특이적 증폭에 의한 위양성 문제를 해결하는 데 기여할 수 있다.
청구항
번호청구항
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제2항에 있어서, 상기 금속이온은 은 이온, 수은 이온, 마그네슘 이온, 백금 이온, 납 이온, 바륨 이온, 스트론튬 이온, 탈륨 이온, 세슘 이온, 및 카드뮴 이온으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 헤어핀 프로브.

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(a) 전기화학적 신호물질이 결합되어 있는 압타머로 수식된 스템(stem) 부위; 및(b) 표적핵산에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하는 루프(loop) 부위;를 포함하는 표적핵산 검출용 헤어핀 프로브.

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제1항에 있어서, 상기 전기화학적 신호물질은 금속이온인 것을 특징으로 하는 헤어핀 프로브.

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제1항에 있어서, 상기 압타머는 전기화학적 신호물질과 결합할 수 있는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 헤어핀 프로브.

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제4항에 있어서, 상기 압타머는 전기화학적 신호물질과 결합할 수 있는 서열은 시토신-시토신 부정합(cytosine-cytosine mismatch)을 포함하는 염기서열, 티민-티민 부정합(thymine-thymine mismatch)을 포함하는 염기서열, 구아닌-구아닌 부정합(guanine-guanine mismatch)을 포함하는 염기서열, 구아닌-아데닌 부정합(guanine-adenine mismatch)을 포함하는 염기서열 및 G 쿼드러플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 헤어핀 프로브.

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다음의 단계를 포함하는 루프 매개 등온 증폭반응(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP) 기반의 표적핵산 검출 방법:(a) 검체 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;(b) (i) 정방향 내부 프라이머, 역방향 내부 프라이머 쌍; (ii) 정방향 외부 프라이머 및 역방향 외부 프라이머쌍; (iii) 중합효소(polymerase); 및 (iv) 디옥시뉴클레오타이드 삼인산(deoxynucleotide triphosphate, dNTP)을 포함하는 조성물을 이용하여 LAMP 반응을 수행하여 표적핵산을 증폭하는 단계;(c) 제1항의 헤어핀 프로브를 상기 증폭산물과 혼성화하여 전기화학적 신호물질을 방출하는 단계; 및(d) 방출된 전기화학적 신호물질에 의해 발생하는 전기화학적 신호의 변화를 측정하여 표적핵산을 검출하는 단계.

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제6항에 있어서, 상기 (c) 단계의 혼성화는 증폭산물의 루프 부위와 헤어핀 프로브의 루프 부위가 서로 상보적으로 결합하여 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.

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(i) 정방향 내부 프라이머, 역방향 내부 프라이머 쌍; (ii) 정방향 외부 프라이머 및 역방향 외부 프라이머쌍; (iii) 중합효소(polymerase); (iv) 디옥시뉴클레오타이드 삼인산(deoxynucleotide triphosphate, dNTP); 및 제1항의 헤어핀 프로브를 포함하는 표적핵산 검출용 조성물.

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(i) 정방향 내부 프라이머, 역방향 내부 프라이머 쌍; (ii) 정방향 외부 프라이머 및 역방향 외부 프라이머쌍; (iii) 중합효소(polymerase); (iv) 디옥시뉴클레오타이드 삼인산(deoxynucleotide triphosphate, dNTP); 및 제1항의 헤어핀 프로브를 포함하는 표적핵산 검출용 키트.