배경: 대장균(E. coli)에서 재조합 단백질을 생산하는 데에는 숙주 균주, 발현 벡터, 배양 배지, 유도 방법과 같은 요인들이 관여한다. 이종 단백질을 생산하기 위한 일반적인 절차는 다음과 같다. (1) 표적 유전자를 적절한 벡터에 삽입하여 과발현 플라스미드를 구성하고, (2) 해당 플라스미드 DNA로 단백질 생산에 특화된 균주를 형질전환하며, (3) 숙주를 적절한 배지에서 배양한 뒤 적절한 시점에 단백질 생산을 유도하고, (4) 최대 수율을 얻기 위해 추가로 배양한다. 각 단계에는 여러 장애물이 있으며, 연구자들은 종종 특별한 조리법이나 절차를 요구하는 다양한 재료 또는 방법을 개발해 왔다. 목적: 쉽게 구할 수 있는 재료를 사용하여 재조합 단백질 생산에 필요한 특수한 요구 사항을 제거한다. 또한 일상적인 단백질 생산 작업에서 시간과 노력을 절감한다. 방법: 우리는 표적 단백질을 말토스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP)의 C-말단에 융합하도록 하는 능력을 갖는 벡터로부터 시작하였다. mCherry(적색 형광 단백질) 유전자를 MBP와 융합하였다. 이는 초기 선별 절차에서 리포터 역할을 하였다. 원래의 치명적 유전자(barnase)를 sacB로 대체하였다. 우리는 3개의 정지기(stationary phase) 프로모터를 선택하고, 각 프로모터에서 절반씩을 혼합하여 그 하이브리드를 만들었다. T5 프로모터를 이 정지기 프로모터 또는 그 하이브리드로 대체하였다. 최적 플라스미드는 세포 펠릿의 색 강도로 선택하였다. MBP 및 GST 유전자를 sacB 자리에 삽입하고, 기존의 발현 방식으로 원래 플라스미드와 단백질 생산 수율을 비교하였다. 결과: 우리는 단백질 생산에 특별히 설계되지 않은 숙주에서도 작동하며, 어떤 비밀 재료도 포함하지 않는 TB 배지에서 작동하는 자동유도(autoinducible) 프로모터를 사용하는 발현 플라스미드를 구성하였다. 또한 Studier의 정의된(defined) 배지와 달리 제조가 어렵지 않았다. 이 플라스미드에는 단백질 생산이 성공하면 적색으로 변하는 색 지시자도 포함되어 있다. 우리는 이 시스템을 말토스 결합 단백질(MBP) 및 글루타티온 S-전이효소(glutathione S-transferase, GST)에 대해 시험하였고, 두 단백질 모두 상용 배지 및/또는 특수화된 균주가 제공하는 수준과 비슷한 정도로 생산됨을 확인하였다. 결론: 우리는 정지기에 활성화되는 두 프로모터의 하이브리드와 자동유도 프로모터를 갖춘 플라스미드를 개발하였다. 이 플라스미드는 특별한 E. coli 균주나 정교하고 복잡하며 값비싼 배지가 필요하지 않다. 또한 강한 적색(또는 분홍색) 색을 생성하는데, 이는 표적 단백질의 성공적인 생산 여부를 나타내는 지표이자 생산된 표적 단백질의 양에 대한 예측 척도로 활용될 수 있다. 우리는 이 플라스미드가 저온에서 세포를 배양할 때, 이는 필연적으로 더 긴 시간이 소요되겠지만, 가장 큰 장점을 가질 것으로 예상한다.

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