▶ 대장암 환자혈장 vs 정상인혈장에 반응하는 장내 마이크로바이오타 발굴 - 건강한 사람(20명)의 혈장 및 대장암 환자(발생 부위별 및 병기별 30명)의 혈장 - 장내미생물 library (629 종)를 이용하여 제작한 장내미생물 microarray chip을 이용하여 cell microbiota microarray 실시 - Gut micribiota microarray 분석을 통하여 대장암 발생에 특이적인 oncomicrobiota의 IgM 및 IgG와 발굴 ▶ 대장암 환자 암 조직 vs 정상조직 연관 장내 마이크로바이오타 발굴 - 대변에서는 확보할 수 없는 대장암 환자의 암 발생 부위별 암 조직 및 정상 장 조직에서 장내 미생물 확보 - 메타지놈(meta genome) 분석으로 암 부위에 많거나 적은 빈도로 존재하는 장내 미생물군집 발굴. - Whole genome sequencing으로 마이크로바이옴(microbiome) 분석 ▶ 장내미생물 array 결과 vs 암 조직에 연관된 온코마이크로바이오타 결과 비교분석 - 대장암 조직 특이 장내미생물과 대장암 환자 혈장을 이용하여 대장암 발생에 관여하는 oncomicrobiota 발굴 - 대장암 발생 시기(TNM)별 및 부위별 특이적 oncomicrobiota 분류 및 클론된 장내미생물 확보 ▶ 대장암 연관 oncomicrobiota 항체 분석 - 대장암 특이적인 oncomicrobiota의 IgM 및 IgG에 대한 아미노산 서열을 Mass spectrometry (MALDI-TOF MS) 등 을 이용하여 분석 - oncomicrobiota에 대한 항체의 isotype을 확인 및 Immunoprecipitation (IP) 또는 co-immunoprecipitation (co-IP) 기법 등을 이용하여 항원을 발굴 ▶ 대장암 연관 oncomicrobiota 항원을 이용한 진단 칩 개발 - 확보한 oncomicrobiota의 항체에 대한 다양한 항원 정보를 이용하여 대장암 조기진단 칩을 제작하여 대장암 환자의 혈장을 이용한 검증 - 기존 출시된 다양한 대장암 진단시약 및 키트와 성능을 비교분석하여 우월성 증명 ▶ 대장암 연관 장내미생물의 단독 및 군집 배양 - 클론된 장내미생물 정보를 이용하여 확보한 대장암 특이 장내 미생물 배양기술 확립 - 대장암 발생 시기별 연관 oncomicrobiota의 분포비율 정보를 응용하여 단독 및 군집배양을 통한 대사체(metabolomics) 분석 ▶ 대장암 연관 장내 미생물의 단독 및 군집을 이용한 마우스 실험 - 정상 마우스 및 염증성대장암 마우스모델을 대상으로 대장암 특이 oncomicrobiota의 상호작용 연구 - oncomicrobiota에 의한 마우스 장을 이용한 유전체 발현 비교분석 ▶ 대장암 연관 oncomicrobiota에 대한 치료 정보 - 대장암 연관 oncomicrobiota들의 공생배양(co-culture)을 통한 상호작용 연구 - 대장암 치료를 위한 oncomicrobiotic 적용으로 다양한 발암조절 기전연구

▶ 대장암 환자혈장 vs 정상인혈장에 반응하는 장내 마이크로바이오타 발굴 - 건강한 사람(20명)의 혈장 및 대장암 환자(발생 부위별 및 병기별 30명)의 혈장 - 장내미생물 library (629 종)를 이용하여 제작한 장내미생물 microarray chip을 이용하여 cell microbiota microarray 실시 - Gut micribiota microarray 분석을 통하여 대장암 발생에 특이적인 oncomicrobiota의 IgM 및 IgG와 발굴 ▶ 대장암 환자 암 조직 vs 정상조직 연관 장내 마이크로바이오타 발굴 - 대변에서는 확보할 수 없는 대장암 환자의 암 발생 부위별 암 조직 및 정상 장 조직에서 장내 미생물 확보 - 메타지놈(meta genome) 분석으로 암 부위에 많거나 적은 빈도로 존재하는 장내 미생물군집 발굴. - Whole genome sequencing으로 마이크로바이옴(microbiome) 분석 ▶ 장내미생물 array 결과 vs 암 조직에 연관된 온코마이크로바이오타 결과 비교분석 - 대장암 조직 특이 장내미생물과 대장암 환자 혈장을 이용하여 대장암 발생에 관여하는 oncomicrobiota 발굴 - 대장암 발생 시기(TNM)별 및 부위별 특이적 oncomicrobiota 분류 및 클론된 장내미생물 확보 ▶ 대장암 연관 oncomicrobiota 항체 분석 - 대장암 특이적인 oncomicrobiota의 IgM 및 IgG에 대한 아미노산 서열을 Mass spectrometry (MALDI-TOF MS) 등 을 이용하여 분석 - oncomicrobiota에 대한 항체의 isotype을 확인 및 Immunoprecipitation (IP) 또는 co-immunoprecipitation (co-IP) 기법 등을 이용하여 항원을 발굴 ▶ 대장암 연관 oncomicrobiota 항원을 이용한 진단 칩 개발 - 확보한 oncomicrobiota의 항체에 대한 다양한 항원 정보를 이용하여 대장암 조기진단 칩을 제작하여 대장암 환자의 혈장을 이용한 검증 - 기존 출시된 다양한 대장암 진단시약 및 키트와 성능을 비교분석하여 우월성 증명 ▶ 대장암 연관 장내미생물의 단독 및 군집 배양 - 클론된 장내미생물 정보를 이용하여 확보한 대장암 특이 장내 미생물 배양기술 확립 - 대장암 발생 시기별 연관 oncomicrobiota의 분포비율 정보를 응용하여 단독 및 군집배양을 통한 대사체(metabolomics) 분석 ▶ 대장암 연관 장내 미생물의 단독 및 군집을 이용한 마우스 실험 - 정상 마우스 및 염증성대장암 마우스모델을 대상으로 대장암 특이 oncomicrobiota의 상호작용 연구 - oncomicrobiota에 의한 마우스 장을 이용한 유전체 발현 비교분석 ▶ 대장암 연관 oncomicrobiota에 대한 치료 정보 - 대장암 연관 oncomicrobiota들의 공생배양(co-culture)을 통한 상호작용 연구 - 대장암 치료를 위한 oncomicrobiotic 적용으로 다양한 발암조절 기전연구

본 과제는 MIR375가 대장암 및 마우스 대장염 조직에서 감소되는 현상을 바탕으로, MIR375와 표적유전자 CTGF의 관계를 밝혀 대장암 조기진단·치료용 분자마커 가능성을 탐색하는 연구임. 연구목표는 MIR375-CTGF 상호기능을 대장암 조직·대장암 세포주·마우스 이종이식에서 규명하고, CRISPR/CAS9로 MIR375 녹아웃 세포주 및 마우스를 제작해 대장염→대장암 발생·진행 기작을 이해하는 데 있음. 연구내용은 pre-MIR375/anti-MIR375 및 CTGF siRNA로 EGFR 신호전달(PI3K/AKT, RAS/RAF/ERK) 조절 여부를 Caco2, HT29, HCT116, SW480에서 분석하고, MTT, cell cycle 및 apoptosis, cell migration, xenograft, 면역염색, cetuximab과의 시너지 평가 수행함. 또한 MIR375 녹아웃에 대한 RNA-seq 및 장기별 mRNA 발현 비교를 통해 발병 기작 규명함. 기대효과는 miRNA·mRNA marker 기반 조기진단·치료 정보 확보, 녹아웃 기반 기전연구 경쟁력 및 염증-암 전환 이해·인력양성 기여임.

▶ 선행연구를 통하여 발굴한 MIR375와 표적유전자 CTGF의 대장염 및 대장암에서 기능을 연구함 ▶ 대장암 발생 및 치료에 중요한 EGFR 신호전달이 MIR375에 의한 CTGF의 조절에 의하는지를 pre-MIR375 및 anti-MIR375를 이용하여 연구함 ▶ EGFR의 중요한 하위 신호전달 경로인 PI3K/AKT 경로 및 RAS/RAF/ERK 경로에 대한 MIR375의 관련 여부를 다양한(Caco2, HT29, HCT116 및 SW480) 대장암 세포주를 이용하여 연구함 ▶ 위 EGFR 하위 신호전달의 결과 내용을 CTGF siRNA를 이용한 연구와 비교하여 대장암에 있어서 MIR375와 CTGF의 상호작용을 분석함 ▶ 위 결과에 따른 다양한(세포의 증식을 알기 위한 MTT 분석, cell cycle 및 apoptosis, cell migration, xenograft 실험, 면역염색 등) 기능연구 수행함 ▶ 대장암세포 증식을 억제하는 항암제(cetuximab)과 MIR375의 시너지효과를 연구함 ▶ 대장암 관련 MIR375의 더 자세한 기능연구를 위하여 CRISPR/CAS9 기법을 응용하여 녹아웃 세포주 및 마우스를 제작함 ▶ MIR375 녹아웃 세포들을 이용하여 transcriptome (RNA-seq)을 수행하여 RNAs의 발현량을 유전체적 측면에서 비교분석 ▶ RNA-seq결과를 바탕으로 MIR375 녹아웃 세포를 이용한 다양한 기능연구를 통한 대장암 발병 기작 규명함 ▶ MIR375 녹아웃 마우스의 표현형 및 장기별 표적 mRNAs의 발현양상 비교