먼저 피부섬유아세포에서 추출한 엑소좀(BJ-5ta Exo)을 이용하여 피부항노화 효과 및 기전의 실험결과입니다. 결과에 따르면 엑소좀은 reactive oxygen species의 생성을 감소시키고 UVB 노출 후 superoxide dismutase 1 and 2, glutathione peroxidase and catalase 발현 수준 감소를 억제했습니다. 또한 UVB 광선에 의해 발현된 nuclear factor erythroid 2‑related factor 2 발현 감소와 TGF‑β1/Smad pathway 활성화를 확인 하였습니다. 동물모델에선 UVB에 의해 유발된 경피 수분 손실, 주름 형성 및 MMP-1 발현 증가를 방지하는 동시에 콜라겐 타입 I 및 엘라스틴의 증가를 확인 하였습니다.
두번째로 피부섬유아세포에서 추출한 엑소좀을 이용하여 미백 효과 및 기전의 실험결과입니다. 먼저 피부섬유아세포 유래 엑소좀의(BJ-5ta-Ex)을 이용한 세포 실험에서 미백 효과(melanogenesis 감소)를 확인 하였는데 특히나 색소 증가와 연관된 다양한 단백질 및 유전자 발현 (tyrosinase activity, microphthalmia-related transcription factor, tyrosinase-related protein-1, and tyrosinaserelated protein-2) 의 감소를 확인 하였습니다. 또한 보다 정확한 효과를 확인하기 위해 추가적으로 인공 피부모델 (3D reconstituted human full skin model)과 ultraviolet B 유도된 동물 실험모델을 통해 조직의 밝기 개선 및 멜라노좀의 분포 감소 등 다양한 항미백 효과를 확인 하였습니다.
해당 세포 실험을 통해 피부섬유아세포 유래 엑소좀의(BJ-5ta-Ex) 색소 형성과 연관된 신호 전달경로 변화(cAMP/PKA 및 GSK-3β/β-catenin 신호전달 경로를 하향 조절 및 MAPK/ERK 신호전달 경로를 상향 조절)를 확인하였으며 또한 -멜라노사이트-자극 호르몬 억제로 인한 멜라노좀 수송에 관여하는 주요 단백질 (rab27a 및 melanophilin)의 발현을 감소도 확인한 것입니다.
1) 1차년도 (2021년)
가. 피부 섬유아세포에서 엑소좀의 분리
● 피부 섬유아세포 증식 - HS68 세포 (human dermal fibroblast)에서 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics가 함유된 배지를 통해서 증식.
● 엑소좀의 분리 및 정제 - 차등 원심분리 및 초미세여과법을 사용.
● 분리된 엑소좀은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관.
나. 분리된 엑소좀의 특성 분석
● 정제 분리된 엑소좀의 positive marker인 D63, CD9, CD81, Alix 및 TSG101을 western blot으로 확인
다. 세포 독성 및 안정성 확인
● 피부세포(human keratinocyte, fibroblast 및 melanocyte)에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률 및 생존률 확인 - 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 MTT assay를 이용하여 평가.
● 이후 CCK-8를 이용한 세포독성 시험을 통해 세포독성이 없는 물질들을 스크리닝.
● 효과있는 농도를 선정하고 농도 의존성을 확인.
2) 2차년도 (2022년)
가. In vitro 미백 효과 확인
● Melanocyte에서 다음 아래와 같은 변화 확인 - 1. 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 2. 멜라닌 단백질의 중간 조절자 (TGF-β1 및 MITF, tyrosinase 및 TRP1/2 등)
● 활성 및 생성 저해시험 - Tyrosinase, DOPA 및 melanin 확인 등
● 기전연구 - Tyrosinase, MITF, ERK, p38및 JNK 레벨 확인
● 인공 피부에서 미백 효능 실험 - 인공 피부 멜라닌 색소의 침착 변화를 대조군과 비교분석, 이후 인공 피부 표피층의 조직학적 변화를 관찰하고 멜라노좀을 염색하여 멜라닌의 침착도를 비교 분석.
나. In vitro 주름개선 효과 확인
● Human dermal fibroblast에서 다음 아래와 같은 변화 확인 - 1. Procollagen 합성능 평가 2.Elastin 합성능 평가 3. MMP-1 억제능 평가 4. collagen I, collagen III mRNA 발현 분석 (real-time PCR) 5. Protein 발현 분석 (western blot) 6. 면역세포화학 염색법
● 기전연구 - ERK, p38, JNK, MMPs, Collagens, TIMP 레벨 확인
● 인공 피부에서 주름개선 효능 실험 - 인공피부의 콜라겐과 엘라스틴의 형성능을 비교 분석.
3) 3차년도 (2023년)
가. In vivo 미백 효과 확인 (마우스 광 노화 모델을 이용한 주름 개선 효능 확인)
● 광노화 모델 제작 - 색소 침착을 유발 시켜 미백 치료에 작용하기 위한 주변 환경 조성 (UVB 311nm를 4주간 주 1회씩 처리 예정, 단 1회 조사량은 490mJ/cm2으로 정함.)
● 유효성 평가를 위한 기기를 이용한 미백 효능 확인
● 조직학적 변화 측정 통하여 미백 효능 재확인 및 관찰
● 조직에서의 western blot와 ELISA 검사를 통하여 변화되는 단백질의 마커 자료 확보.
● 미백 효과 메카니즘 과정 규명 및 근거 확보.
나. In vivo 주름개선 효과 확인 (마우스 광 노화 모델을 이용한 미백 효능 확인)
● 광노화 모델 제작 - 광노화에 의한 얕은 주름을 유발하기 위하여 주 3회, 20주 동안 UVA와 UVB를 조사.
● 유효성 평가를 위한 기기를 이용한 육안적 주름 개선 효능 확인
● 조직학적 변화 측정 통하여 주름 개선 효능 재확인 및 관찰
● 조직에서의 western blot와 ELISA 검사를 통하여 변화되는 단백질의 마커 자료 확보.
● 주름 개선 효과의 메카니즘 과정 규명 및 근거 확보.