1) 1차년도 (2021년) 가. 피부 섬유아세포에서 엑소좀의 분리 ● 피부 섬유아세포 증식 - HS68 세포 (human dermal fibroblast)에서 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics가 함유된 배지를 통해서 증식. ● 엑소좀의 분리 및 정제 - 차등 원심분리 및 초미세여과법을 사용. ● 분리된 엑소좀은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관. 나. 분리된 엑소좀의 특성 분석 ● 정제 분리된 엑소좀의 positive marker인 D63, CD9, CD81, Alix 및 TSG101을 western blot으로 확인 다. 세포 독성 및 안정성 확인 ● 피부세포(human keratinocyte, fibroblast 및 melanocyte)에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률 및 생존률 확인 - 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 MTT assay를 이용하여 평가. ● 이후 CCK-8를 이용한 세포독성 시험을 통해 세포독성이 없는 물질들을 스크리닝. ● 효과있는 농도를 선정하고 농도 의존성을 확인. 2) 2차년도 (2022년) 가. In vitro 미백 효과 확인 ● Melanocyte에서 다음 아래와 같은 변화 확인 - 1. 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 2. 멜라닌 단백질의 중간 조절자 (TGF-β1 및 MITF, tyrosinase 및 TRP1/2 등) ● 활성 및 생성 저해시험 - Tyrosinase, DOPA 및 melanin 확인 등 ● 기전연구 - Tyrosinase, MITF, ERK, p38및 JNK 레벨 확인 ● 인공 피부에서 미백 효능 실험 - 인공 피부 멜라닌 색소의 침착 변화를 대조군과 비교분석, 이후 인공 피부 표피층의 조직학적 변화를 관찰하고 멜라노좀을 염색하여 멜라닌의 침착도를 비교 분석. 나. In vitro 주름개선 효과 확인 ● Human dermal fibroblast에서 다음 아래와 같은 변화 확인 - 1. Procollagen 합성능 평가 2.Elastin 합성능 평가 3. MMP-1 억제능 평가 4. collagen I, collagen III mRNA　발현 분석 (real-time PCR) 5. Protein 발현 분석 (western blot) 6. 면역세포화학 염색법 ● 기전연구 - ERK, p38, JNK, MMPs, Collagens, TIMP 레벨 확인 ● 인공 피부에서 주름개선 효능 실험 - 인공피부의 콜라겐과 엘라스틴의 형성능을 비교 분석. 3) 3차년도 (2023년) 가. In vivo 미백 효과 확인 (마우스 광 노화 모델을 이용한 주름 개선 효능 확인) ● 광노화 모델 제작 - 색소 침착을 유발 시켜 미백 치료에 작용하기 위한 주변 환경 조성 (UVB 311nm를 4주간 주 1회씩 처리 예정, 단 1회 조사량은 490mJ/cm2으로 정함.) ● 유효성 평가를 위한 기기를 이용한 미백 효능 확인 ● 조직학적 변화 측정 통하여 미백 효능 재확인 및 관찰 ● 조직에서의 western blot와 ELISA 검사를 통하여 변화되는 단백질의 마커 자료 확보. ● 미백 효과 메카니즘 과정 규명 및 근거 확보. 나. In vivo 주름개선 효과 확인 (마우스 광 노화 모델을 이용한 미백 효능 확인) ● 광노화 모델 제작 - 광노화에 의한 얕은 주름을 유발하기 위하여 주 3회, 20주 동안 UVA와 UVB를 조사. ● 유효성 평가를 위한 기기를 이용한 육안적 주름 개선 효능 확인 ● 조직학적 변화 측정 통하여 주름 개선 효능 재확인 및 관찰 ● 조직에서의 western blot와 ELISA 검사를 통하여 변화되는 단백질의 마커 자료 확보. ● 주름 개선 효과의 메카니즘 과정 규명 및 근거 확보.