고형암 특이적 고농도 ROS의 면역억제 미세환경에서도 높은 항암 활성을 유지하는 신규 CAR-T 세포 치료제 개발

가. 1차 연도 - 개발 목표 종양 특이적 고농도 ROS와 NRF2 발현관계 이해 및 CD8 T 세포 반응성에서 NRF2 역할 규명 - 연구개발 내용 및 범위 1) ROS 농도에 따른 T 세포의 NRF2 발현 양상 조사 2) NRF2 KO T 세포를 이용한 ROS 농도에 따른 T 세포 반응성 규명 3) ROS 농도에 따른 NRF2 발현 변화에 따른 면역 세포 아형별 영향 분석 4) in vitro 독성 T 세포 활성 분석 및 반응 관련 인자 확인 (cytokine profile, proliferation 정도) 5) NRF2 과발현 동물 모델 구축; T 세포 특이 NRF2 과발현 동물 모델 구축. 나. 2차 연도 - 개발 목표 NRF2 발현에 의한 T 세포 항암 면역반응 조절 기전 규명 - 연구개발 내용 및 범위 1) T 세포 특이적 NRF2Tg mouse 면역 세포 분석 2) NRF2 결핍, 과발현 T 세포를 이용한 in vitro assay 실시 3) NRF2 결핍 동물의 암증식 억제에서 T 세포 역할 규명: 특정 면역 세포 제거용 항체를 이용한 T 세포 특이 항암 면역 반응에서 NRF2 역할 확인 4) NRF2 과발현 동물 이용 항암 T 세포 면역 반응 및 암 증식 양상 확인 5) mRNA microarray 또는 RNA-seq을 통해 NRF2 발현 변화에 따른 관련 유전자 발현 변화 분석 6) NRF2에 의한 T 세포 반응성 조절 기전 규명 다. 3차 연도 - 개발 목표 NRF2 제어 T 세포 항암 면역반응 전임상 연구 및 CAR-T 세포 제작 기반 구축 - 연구개발 내용 및 범위 1) NRF2 발현에 따른 종양 내 면역 세포 활성 분석 및 종양의 조직병리학적 분석 2) 항원 특이적 NRF2 결핍, 과발현 독성 T 세포 발현 동물 구축 3) NRF2 발현이 다른 항원 특이적 독성 T 세포의 adoptive transfer를 이용한 항암 T 세포 면역반 응 전임상 시도 4) NRF2KO or Tg 인간 CD19 CAR T 세포 제작

- 다양한 종류의 cytokine 중에서도 특히 gc cytokine들이 면역 세포 발생 및 항상성에 매우 중요한 역할을 하기 때문에 이들의 조절 기전과 신호 조절 네트워크에 관한 이해가 매우 중요함. - gc cytokine에는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21이 있으며 그들의 수용체는 gc를 subunit으로 공유함. - 일반적으로 gc 발현은 상대적으로 일정하며 단지 신호 전달의 필수 보조 단백질로 알려져 있었기 때문에, gc 보다는 각각의 특이 수용체에 의해 gc cytokine 신호가 조절될 것이라고는 생각함 (Rochman et al., 2009). - 따라서 gc cytokine 특이 수용체들의 발현 조절 기전에 관한 연구는 매우 활발하게 이루어졌으나, gc 그 자체에 대한 발현 조절 기전과 신호 조절에 대해서는 알려진 바가 없음 (Spolski et al., 2018). - 본 연구진의 기존 연구결과에 의하면 T 세포 발생 과정에서 γc 발현이 매우 역동적으로 조절되는 것이 확인됨. 실제로 DP 단계의 흉선 세포에서 매우 낮은 발현을 보임 (Park et al., 2016). - 또한 활성 T 세포에서 나이브 T 세포에 비해 현저한 gc 발현 증가가 확인됨. 이는 단백질과 mRNA 수준에서 모두 증가하는 것으로 확인됨 (Kim et al., 2018). - 또한 본 연구진에 의해 최초로 규명된 sgc의 cytokine 신호 조절 능력은 gc가 신호전달의 단순 보조 역할이 아닌 cytokine 신호 조절에 관여할 수 있음을 보여줌 (Park et al., 2016 and Kim et al., 2018a and 2018b). - 즉 이들의 발현이 역동적으로 조절되며 γc cytokine 신호 또한 이들에 의해 조절될 수 있음을 보여줌 (Park et al., 2016, Kim et al., 2018a and 2018b, Lee et al., 2019). -gc 발현의 조절 가능성에 기초하여 gc 발현 조절 기전 규명과 조절 인자 발굴에 중점을 둠. -T 세포 유래 세포주인 EL-4를 이용하여 gc 발현 조절 인자 탐색. -신규 발굴 gc 발현 조절 인자의 제어를 통한 gc 발현 조절 기전 분석 및 검증. -기 국축된 gc 발현 조절 불능 동물 모델을 이용한 gc에 의한 gc cytokine 신호 조절 연구

본 과제는 선천성 CD8 T 세포가 어떻게 만들어지고 바이러스 방어 같은 기능을 갖는지 밝히기 위해, 유전자가 다양한 마우스 패널인 collaborative Cross(CC)를 활용해 핵심 유전자를 찾는 연구임. 연구 목표는 선천성 CD8 T 세포 발달 조절 기전 이해와 조절 분자 규명, CC 기법의 다양한 종 분석, 분화 및 기능에 작용하는 주요 표적 유전자 분석에 있음. 핵심 연구 내용은 non-classical MHC I 관련 T세포 수용체 특성, 흉선 PLZF+ NKT 세포 유래 IL-4에 의한 Eomes 유도, ITK·CBP·KLF2·Id3 결핍 마우스에서의 분화 경로 확인, IL-4 유도 선천성 CD8 T 세포의 바이러스 감염 조절 역할 평가, CC를 통한 효과 유전자 발굴임. 기대 효과는 선천성 CD8 T세포 연구에 새로운 paradigm 제시와 과발현·결여 동물 모델 확보, 복잡한 형질의 빠른 mapping 기반 기술 경쟁력 및 항암면역 등 면역 조절 타겟 발굴에 기여함.