연구목표에 도달하기 위하여 다음과 같은 연구를 수행함. 1. 시스템 생물학을 이용한 대사체 생합성 global regulator 탐색 - 선행 연구로 확보된 미생물 Streptomyces sp., Colletotrichum sp. 등에서 전체 전사체와 전체 대사체를 분리함. - 분리한 전사체(transcriptome)를 시퀀싱함. 대사체(metabolome)을 LC-MS/MS에 기반한 분자 네트워킹(molecular networking) 분석법을 이용하여 대사체의 차이를 분석함. 이를 바탕으로 대사체의 생산이 증가된 조건에서 전사량이 증가한 유전자를 선별하여 global regulator 후보군을 설정함. - 선별된 전사인자 유전자를 클로닝 및 과발현하여 극한 조건에서의 생산 여부를 확인하여 최종 global regulator 유전자를 선별함. 2. 대사체 분석기법을 이용한 cryptic 대사체 발굴 - 질량분석기를 이용하여 대사체 분석 후 다변량 통계기법을 이용하여 cryptic 대사체 패턴 확인 및 선발. - 분자 네트워킹 분석기법을 이용하여 LC-MS/MS로 분석한 MS fragmentation을 기반으로 대사체 구조 간 클러스터링을 수행함. - 분자 네트워킹 분석기법으로 확보한 클러스터링을 분석하여, cryptic 대사체 및 신규 유도체를 프로파일링하여 표적 분리의 정보를 제공함. 3. 신규 cryptic 대사체의 표적 분리 및 구조규명 - 분자 네트워킹 결과를 기반으로 선발된 신규 cryptic 대사체에 대한 표적화를 통하여 빠르고 효율적으로 대사체를 분리함. NMR, MS, ECD, VCD등의 기기분석을 통해 신규 cryptic 대사체의 구조를 결정함. 4. Cryptic 대사체의 항생제 내성균에 대한 항균활성 연구 - 각 대사체의 항생제 내성균에 대한 항생력, quorum sensing 관련/비관련 독소 생산 및 바이오필름 조절 능력 등을 아래와 같은 실험 방법을 사용하여 조사함. ㆍMIC, MBC 측정을 통한 항생제 내성균의 생장 저해/사멸 효과 확인 ㆍqRT-PCR이나 RNA-seq을 이용한 표적 발병인자의 발현 변화 확인 ㆍ단백질 및 펩타이드 독소의 정량 분석을 통한 독소 생산량 변화 확인 ㆍ바이오필름 정량 분석을 통한 바이오필름 형성 변화 확인

‣1차년도: 멀티플렉스 공배양 시스템 본 연구 과제에서 사람 피부에 공존하는 공생균과 병원균 사이의 상호작용에 활용하고자 하는 핵심 기술인 멀티플렉스 공배양 시스템은 반투과성막을 가진 microtiter plate의 well 안에 삽입 가능한 형태의 플라스틱 지지체인 Transwell을 활용하여 두 종의 미생물이 직접 접촉하지 않으면서도 분비체는 상호 교환할 수 있는 환경을 조성해주어 완벽한 분리가 가능한 공배양을 구현하고자 한다. ‣2차년도(1): 공생균과 병원균 각각의 펩타이드 분비체에 따른 병원균 억제 효과 연구 MRSA를 포함하는 S. aureus의 중요한 펩타이드 독소이자 바이오필름 형성, 미생물 간섭, 유전자 신호전달에 중요한 역할을 하고 있는 PSM(phenol-soluble modulin)의 돌연변이주 및 피부공생균의 대표 격인 S. epidermidis의 PSM 돌연변이주를 이용하여 각각의 야생주와의 비교 분석을 통해, PSM이 S. aureus의 피부 colonization에 차지하는 역할에 대한 연구를 수행한다. ‣ 2차년도(2): 병원균에 대한 억제력이 있는 공생균의 탐색 공배양 시스템의 하부 플레이트에 S. aureus 혹은 다른 병원균을 같은 농도로 접종한 뒤 상부 플레이트에는 S. epidermidis를 포함하는 다양한 공생균을 서로 다른 접종량비로 공배양하여 S. aureus에 대한 피부 colonization 억제력이 있는 공생균과 접종량비 모두를 동시에 탐색한다. 또 다른 피부 공생균인 CoNS들의 PSM 유사 분비 펩타이드의 존재는 본 연구자의 선행 연구로 밝혀져 있으나, 아직 그 역할에 대한 규명이 필요한데 이를 병원균의 colonization 방지라는 가설 하에 공배양 시스템을 이용해 규명하고자 한다. ‣3차년도: 인체 피부 환경의 대표 인자들에 대한 공생균:병원균 상호작용 균형 변화 연구 인체의 피부 환경을 결정하는 요인들로는 수분, 유분, 염도, pH 등을 들 수 있다. 이 각각의 요인을 결정하는 물질들을 S. epidermidis와 S. aureus를 비롯한 공생균/병원균 멀티플렉스 공배양 시스템에 적용하여 공생균과 병원균간 균형의 유지 및 파괴에 영향을 미치는 주요 환경 인자를 탐색하고자 한다.

‣1차년도: 멀티플렉스 공배양 시스템 본 연구 과제에서 사람 피부에 공존하는 공생균과 병원균 사이의 상호작용에 활용하고자 하는 핵심 기술인 멀티플렉스 공배양 시스템은 반투과성막을 가진 microtiter plate의 well 안에 삽입 가능한 형태의 플라스틱 지지체인 Transwell을 활용하여 두 종의 미생물이 직접 접촉하지 않으면서도 분비체는 상호 교환할 수 있는 환경을 조성해주어 완벽한 분리가 가능한 공배양을 구현하고자 한다. ‣2차년도(1): 공생균과 병원균 각각의 펩타이드 분비체에 따른 병원균 억제 효과 연구 MRSA를 포함하는 S. aureus의 중요한 펩타이드 독소이자 바이오필름 형성, 미생물 간섭, 유전자 신호전달에 중요한 역할을 하고 있는 PSM(phenol-soluble modulin)의 돌연변이주 및 피부공생균의 대표 격인 S. epidermidis의 PSM 돌연변이주를 이용하여 각각의 야생주와의 비교 분석을 통해, PSM이 S. aureus의 피부 colonization에 차지하는 역할에 대한 연구를 수행한다. ‣ 2차년도(2): 병원균에 대한 억제력이 있는 공생균의 탐색 공배양 시스템의 하부 플레이트에 S. aureus 혹은 다른 병원균을 같은 농도로 접종한 뒤 상부 플레이트에는 S. epidermidis를 포함하는 다양한 공생균을 서로 다른 접종량비로 공배양하여 S. aureus에 대한 피부 colonization 억제력이 있는 공생균과 접종량비 모두를 동시에 탐색한다. 또 다른 피부 공생균인 CoNS들의 PSM 유사 분비 펩타이드의 존재는 본 연구자의 선행 연구로 밝혀져 있으나, 아직 그 역할에 대한 규명이 필요한데 이를 병원균의 colonization 방지라는 가설 하에 공배양 시스템을 이용해 규명하고자 한다. ‣3차년도: 인체 피부 환경의 대표 인자들에 대한 공생균:병원균 상호작용 균형 변화 연구 인체의 피부 환경을 결정하는 요인들로는 수분, 유분, 염도, pH 등을 들 수 있다. 이 각각의 요인을 결정하는 물질들을 S. epidermidis와 S. aureus를 비롯한 공생균/병원균 멀티플렉스 공배양 시스템에 적용하여 공생균과 병원균간 균형의 유지 및 파괴에 영향을 미치는 주요 환경 인자를 탐색하고자 한다.

<1단계> (1) 1차년도(2017) 다제내성 황색포도구균의 독성/내성 관련 숙주-병원균 및 병원균-(비)병원균간 외부 신호전달 환경인자 탐색 ○ 황색포도구균의 주요 숙주인 인체에서 병원균의 집락화(colonization) 및 감염 발생 부위의 환경인자 탐색 ○ 병원균-(비)병원균간 외부 신호전달 환경인자 탐색 ○ 숙주-병원균 및 병원균-(비)병원균 각각에 대한 외부 신호전달 환경인자 D/B 확보 (2) 2차년도(2018) 숙주-병원균 및 병원균-(비)병원균간 외부 신호전달 환경인자의 독성/내성 관련 특성분석 ○ 숙주-병원균간 외부 신호전달 환경인자 특성 분석 ○ 병원균-(비)병원균간 외부 신호전달 환경인자 특성 분석 ○ 외부 신호전달 환경인자의 독성/내성 관련 조절 특성 분석 (3) 3차년도(2018) 숙주-병원균 및 병원균-(비)병원균간 외부 신호전달 환경인자의 선정 및 확보 ○ 외부 신호전달 환경 인자 선정 및 확보 방안 검토 ○ 대량배양, 분리정제 등을 통한 외부 신호전달 환경 인자 확보 ○ 외부 신호전달 환경인자 관련 독성/내성 조절 표적 분자 발굴을 위한 기반기술 확보 <2단계> 타 세부/위탁 과제와의 협력 오믹스 연구를 통한 표적 분자 탐색 및 발굴 발굴된 표적 분자의 in vitro 실험 및 변이주 제작 등을 통해 표적 분자 기능 검증 <3단계> 타 세부/위탁 과제와의 협력 오믹스 연구를 통해 표적 분자에 대한 제어물질 탐색 탐색된 후보 물질을 이용한 외부 신호전달 제어 및 독성/내성 조절 효과 검증