(1) 1차년도 •안압 상승에 의한 미세아교세포의 활성화에 관여하는 주요 후보물질 탐색 - 미세아교세포를 pressure chamber에서 배양한 뒤 단일세포 RNA 시퀀싱을 하여 대조군과 비교 분석 •녹내장에서 S-nitrosylation의 후보 단백질 도출 - 정상대조군과 녹내장 환자의 기증 안구에서 채취한 망막 샘플에서 의미있게 차이를 보이는 S-nitrosylation 된 단백질을 unbaised mass spect analysis를 통해 도출 (2) 2차년도 •도출한 후보 단백질의 망막 발현 및 기전 연구 - 단일세포 RNA 시퀀싱에 의해 발굴한 후보물질의 변화를 녹내장 동물모델의 망막에서 관찰 - 기증 안구의 망막에서 확인한 S-nitrosylation되는 후보 단백질을 녹내장 동물모델의 망막에서 관찰 - 미세아교세포와 후보 S-nitrosylation 단백질의 상관 관계 분석 •S-nitrosylation 되는 타깃단백질의 기능 연구 - 녹내장 동물모델에서 타깃단백질의 S-nitrosylation을 억제할 경우 신경염증 관련 인자들의 변화 확인 - S-nitrosylation에 따른 타깃단백질의 기능과 관련 기전의 변화 확인 (3) 3차년도 •산화질소 변화에 따른 미세아교세포에서의 S-nitrosylation 변화와 망막신경졀세포의 세포사와의 관련 연구 - 녹내장 동물모델에서 타깃의 S-nitrosylation 억제 후 망막의 신경염증 정도와 미세아교세포의 변화를 확인 - 망막의 산화질소 발현의 변화를 주는 약제 투여 후 S-nitrosylation 및 신경염증의 변화 확인 - 녹내장 동물모델에서 타깃의 S-nitrosylation 억제 후 망막신경절세포의 변화와 시기능의 변화 확인 •산화질소의 변화를 주는 약제의 시신경보호 효과 검증 - 녹내장 동물모델에서 산화질소 관련 약제에 의한 S-nitrosylation 기능 변화 연구와 망막신경절세포의 세포사에 미치는 영향 관찰 - 녹내장 동물모델에서 산화질소 관련 약제에 의한 S-nitrosylation 변화가 시기능에 미치는 영향 확인

본 과제는 녹내장에서 안압 상승뿐 아니라 허혈 손상도 시신경 손상을 유발할 수 있다는 점에 주목해, 망막신경절세포가 죽는 방식이 손상 원인에 따라 달라짐을 밝히는 연구임. 연구 목표는 안압 상승과 허혈 손상에 대해 necroptosis가 얼마나 관여하는지 확인하고, apoptosis와 함께 세포사 기전이 달라지는 원인-연관성을 규명해 원인 기반 개별화 치료 전략의 발판을 마련하는 데 있음. 동물모델(만성 안압상승, 허혈-재관류)과 in vitro 실험에서 caspase-3/8/9, RIP1, RIP3, beclin-1, MAPK, PI3K 등을 분석하고 necrostatin으로 억제 효과를 검증함. 기대 효과는 necroptosis 신호경로 규명과 시신경 보호 치료 타겟 도출, 신규 물질 특허 및 치료제 개발 가능성 확대임.

1) 기증안구의 공막 및 사상판의 DNA methylation 분석 - 후극부 공막 및 사상판을 채취하여 DNA methylation pattern을 한국인과 서양인의 기증안구에서 비교분석 한다. 주로 공막과 사상판의 주 구성성분인 collagen과 elastin의 유전자의 promoter region을 대상으로 한다. 2) 만성 안압상승모델에서 망막신경절세포의 methylation 분석 - 만성 안압상승모델을 제작한 후 망막을 채취하여 DNA methyltransferase와 histone acetyltranferase/methyltransferase 발현 변화를 분석 kit를 이용하여 안압 상승 전과 후의 변화를 관찰한다. 또한 변화가 관찰된 DNA methyltransferase와 histone acetyltranferase/methyltransferase의 subtype을 western blot analysis와 immunohistochemistry 염색을 통해 분석하여 망막에서의 변화를 관찰한다. 3) 만성 안압상승모델에서 공막 및 사상판의 DNA methylation 분석 - 만성 안압상승 동물모델에서 안압 상승 전과 후의 공막과 사상판의 DNA methylation 패턴을 분석 비교하여 특성을 도출한다. 또한 만성 안압상승 동물모델에서 변화가 있는 epigenetic pattern을 western blot analysis와 immunohistochemistry 염색을 통해 확인해보고, 안압 상승 후 세포사 하는 망막신경절세포에서 변화가 되는지 TUNEL 염색과 망막신경절세포 특수 염색을 통해 함께 발현 변화를 본다. 4) Histone deacetylase/demethyltransferase 억제에 의한 망막신경절세포의 세포사 변화 관찰 - 망막신경절세포에서 안압 상승 전과 후로 유의한게 변한 epigenetic modification target을 억제하거나 촉진하는 물질의 적용 후 변화를 western blot analysis와 immunohistochemistry 염색을 통해 확인한다. 또한 변화가 망막신경절세포의 세포사에 어떻게 기여하는지 TUNEL 염색과 망막신경절세포 특수 염색을 통해 관찰한다. - 만성 안압상승모델의 공막과 사상판에서의 변화도 함께 관찰하고 지지구조물들의 변화가 망막신경절세포의 세포사에 관여하는지 확인한다. - 위의 결과들을 통해 공막과 사상판의 epigenetic modification이 녹내장의 발생에 어떤 방향으로 작용하는지 규명하고 치료에의 epigenetic target을 선정해본다.

○ 만성 안압상승모델에서 망막전층의 시냅스 변화 관찰 - 망막전층에서 시냅스가 연접하는 층인 inner plexiform layer 및 outer plexiform layer의 변화를 우선 확인한다. Synaptophysin을 이용하여 western blot analysis 및 면역형광염색을 통해 시냅스 연접층이 녹내장 유발 후 변성이 되는지 연구진의 모델에서 확인한다. 또한 시냅스의 변화를 녹내장 유발 전 후로 전자현미경으로 관찰하여 특성을 파악해본다. ○ 만성 안압상승모델에서 하나의 망막신경절세포의 수상돌기 및 연접의 변화 관찰 - 망막의 세포 하나하나를 관찰할 수 있는 방법인 single-cell Lucifer yellow injection 방법을 이용하여 망막신경절세포를 관찰한다. 망막신경절세포의 형태, 수상돌기의 분지양상, 크기, 및 분포를 살펴보고 녹내장 유발 후의 변화를 분석한다. 또한 두극세포와의 연접 부위의 변화를 관찰하여 녹내장 유발 후 어떤 양상으로 변화하는지 관찰한다. ○ 만성 안압상승모델에서 neurotrophic factor 적용에 의한 시냅스 변화 관찰 - 위의 결과를 바탕으로 녹내장 유발 후 망막 전층 및 망막신경절세포에서 시냅스 및 그 연접의 변화가 neurotrophic factor 적용 후 변화하는지 관찰한다. Neurotrophic factor는 대표적으로 망막에서 연구가 되고 있는 brain derived neurotrophic factor와 nerve growth factor를 사용한다. ○ 시냅스 변화가 망막신경절세포의 생존 및 기능이 미치는 영향을 분석 - 시냅스의 변화가 망막신경절세포의 생존에 미치는 영향을 세포사 확인을 통해 살펴보고, 망막신경절세포의 기능에 미치는 영향을 망막신경전위도 검사를 통해 관찰한다.