인간 유래 피부각질세포-감각신경세포 공동 배양 모델을 활용해 피부각질세포의 유전자 변화가 감각신경세포 활성에 영향을 미치는 구체적 기전을 파악하고 해당 인자와 STAT3의 조절 관계 및 연관성을 파악, 이를 통해 소양증 유발 기전을 밝히고자 한다.

연구내용 1) 각질세포 유래 새로운 소양증 조절 인자 선정 1-1) NGS 분석을 통한 각질세포 유래 소양증 조절 인자 후보군 선별 1-2) 조절 인자 후보군 유효성 평가 및 조절 인자 선정 2) 선정된 조절 인자를 중심으로 소양증의 신호전달기전 규명 • 전사 조절자 가능성 확인 (Chromatin Immunoprecipitation, Luciferase assay 등) • 신호 전달 복합체 구성 인자 가능성 확인 (Immunoprecipitation 등) • STAT3 신호전달기전과의 연관성 확인 (Western blot, RT-PCR 등) 3) 소양증 연구를 위한 3D 피부 모델 구축 및 Cross-talk 기전 규명 3-1) 3D 피부 모델 구축 (신경세포 공생 배양 3D 피부 모델) • 기존 3D 피부 모델을 이용한 연구는 dermis, epidermis를 포함한 피부 세포만을 이용한 모델이라는 한계점 때문에 소양증과 피부 각질세포간의 단편적 관련성만 파악이 가능 • 세포 간의 Cross-talk과 그에 따른 소양증과의 관계를 규명하기 위한 3D 피부 모델의 구축을 계획 • 선별된 신규 조절 인자의 각질세포 내 기능 뿐 아니라 분비를 통한 세포 외 기능의 가능성을 고려함 3-2) 세포간 Cross-talk과 그에 따른 소양증 관련 기전 규명 (Western blot, RT-PCR 등) • 신경세포의 증식 및 활성도 측정 (nerve fibers, TRP family channel 등의 형광 염색) • Neurotransmitters 및 Ion channels 분석 (세포 배양 배지 함량 분석, Ion channel activity 측정 등) • 특정 세포(각질세포)의 조건을 변화시키고 그에 따른 다른 세포들과의 Cross-talk 변화 및 소양증 마커 유전자의 발현 변화 등을 복합적으로 실험하고 관련 기전을 규명 (Western blot, RT-PCR 등)

피부각질세포에서의 STAT-3활성화 기전 및 피부장벽기능 단백질의 조절기전 규명하고, 전사수준에서의 STAT-3에 의한 fillagrin 및 claudin-1, AMPs 유전자 조절 기전 확인함. 또한 피부각질세포에서의 STAT-3의존적 피부장벽 기능 단백질 및 항균펩타이드 발현 조절 기전 확립함. 그리고 STAT3의 과발현 및 knock-down 세포주를 이용하여 STAT-3 의존적 피부장벽 기능 단백질 및 항균펩타이드 발현 조절을 확인함. 또한, 3차원피부모델 및 생쥐를 이용한 STAT의존적 피부장벽 기능 단백질 및 항균펩타이드 발현 조절을 확인함. 마지막으로, 동물 모델 및 아토피 환자 피부조직에서 STAT-3의존적 피부장벽기능 단백질 및 항균펩타이드 발현 신호전달 기전 규명을 위해 피부 특이적 STAT-3 형질전환 마우스를 제작함. 이러한 마우스를 통한 조절기전을 확인. 또한, 아토피 피부염환자 피부조직에서의 STAT-3/피부장벽기능 단백질/항균펩타이드의 상호발현을 확인함.

1차년도> HIF-1α에 의한 인간 유래의 피부각질세포의 과다 증식 및 분화 조절 기전 확인 1. Ca2+처리에 의한 피부세포 분화조건에서 HIF-1α 과발현에 따른 세포증식, 세포주기 분석 2. HIF-1α 과발현에 의한 keratin 10(K10), involucrin(INV), loricrin(LOR)를 비롯한 다양한 피부각질세포 분화마커들의 발현 검증 전사수준에서의 HIF-1α에 의한 BMP6유전자 조절 기전 확인 1. BMP6 promoter의 HIF-1α 결합부위 point mutant construct 제작 2. 상기 제작된 BMP6 promoter mutant를 이용한 HIF-1α에 의한 BMP6유전자 전사조절 활성확인 3. Chip assay 이용한 HIF-1α의 직접적 결합여부 확인 4. EMSA assay 이용한 HIF-1α의 직접적 결합여부 검증 2차년도> BMP6 과발현 및 Knock-down 세포주 확립 BMP6에 의한 인간 유래의 피부각질세포의 과다 증식 및 분화 조절 기전 확인 1. Ca2+처리에 의한 피부세포 분화조건에서 BMP6처리에 따른 세포증식, 세포주기 분석 2. BMP6처리에 의한 K10 INV, LOR를 비롯한 다양한 피부각질세포 분화마커들의 발현 양상 검증 HIF-1α/ BMP6신호전달에 의한 인간 피부각질세포의 과다 증식 및 분화 조절 기전 확인 1. HIF-1α 과발현 세포주에 Ca2+분화유도후 BMP6 처리에 따른 세포증식, 세포주기 분석 2. HIF-1α 과발현 세포주에 Ca2+분화유도후 BMP6 처리에 의한 피부각질세포 분화마커들의 발현 양상 검증 3차 년도> BMP6 형질전환 마우스 제작을 통한 조절기전 확인 1. 면역조직화학염색을 통한 피부각질세포의 증식 및 분화 확인 2. BMP6의 발현감소로 인한 피부 병변 확인 마우스모델에서 HIF-1α/BMP6 신호전달 기전확인 1. 마우스 건선 모델에서 BMP6처리에 따른 피부각질세포의 변화 양상확인. 2. 마우스 피부 조직내 HIF-1α 특이적 siRNA 전달을 통한 BMP-6 발현 억제 확인 및 피부 병변의 변화 확인 건선환자 피부조직에서 HIF-1/BMP6 상호발현 확인 및 피부각질세포의 분화마커 발현 확인