Imeglimin (이메글리민)은 미토콘드리아 기능을 개선시키는 작용기전으로 베타세포 기능이상과 인슐린 저항성을 동시에 개선하는 효과로 주목받고 있는 최초의 글리민 계열의 당뇨병 신약이나 심혈관질환 안전성에 대한 평가가 필요한 실정임. 따라서 imeglimin이 대식세포매개 염증반응 제어효과 및 이와 연관된 작용기전을 규명하고 당뇨병을 유발시킨 ApoE-/...

1차년도 : Imeglimin이 대식세포 매개 염증반응에 미치는 효과 규명 ○ PMA로 분화시킨 THP-1 macrophage에 다양한 자극 (LPS, ox-LDL, PA, glucose 등)으로 유발시킨 염증반응에 imeglimin 효과 조사 ▶ imeglimin의 proinflammatory cytokine (TNF-α, IL-1β, IL-6) 발현 억제 여부 조사 (Westeron blot, ELSIA) ▶ imeglimin의 NLRP3 inflammasome 활성화에 미치는 효과 확인 - inflammasome components (NLRP3, ASC, caspase-1), IL-18, IL-1β의 mRNA과 protein 발현 측정 - ASC speck formation, oligomerization에 미치는 효과 확인 - 세포 배양 상층액에서 ELISA로 caspase-1, IL-1β, IL-18의 activity 측정 ▶ imeglimin의 caspase-4/5/11비고전적 inflammasome 활성화에 미치는 효과 확인 ▶ imeglimin의 TLR/NF-κb 신호 전달계에 미치는 효과 확인 TLR4, MyD88, NF-kB mRNA, protein 발현에 미치는 효과 확인 ▶ inflammation 관련된 신호전달계 MAPK ▶ imeglimin의 Gasdermin-mediated pyroptosis 에 미치는 효과 확인 2차년도 : Imeglimin의 항염증효과의 기전을 mitochondria을 중점으로 규명 ○ 1차년도 연구를 통해서 확인된 대식세포매개 염증반응을 제어하는 imeglimin의 작용기전 규명 ▶ Imeglimin이 intracellular, mitochondria ROS 생성에 미치는 효과 확인 ▶ Imeglimin이 mitochondrial permeability transition pore opening에 미치는 효과 관찰 ▶ Imeglimin이 mitochondrial DNA(mtDNA), oxidized mtDNA의 생성에 미치는 효과 관찰 ▶ Imeglimin이 mitochondrial membrane potential, 산소소비율량, ATP 생성에 미치는 효과 확인 ▶ mitochondrial anti-oxidant enzyme : MnSOD, glutathione peroxidase(GPX)-1, superoxide dismutase (SOD)2 ▶ mitochondrial biogenesis 관련된 유전자에 미치는 영향 : PGC-1α, NRF-1, TFAM 3차년도 : Imeglimin이 diabetic ApoE-KO mouse에서 atherosclerotic plaque 감소효과 규명 ○ ApoE-KO control 군, diabetic-ApoE-KO placebo군, diabetic-ApoE-KO imeglimin 투여군으로 실험 ▶ 당부하 검사, 인슐린 내성 검사 ▶ 염증성 사이토카인: plasma TNF-α, IL-1β, IL-6 측정 ▶ 죽상경화증에 미치는 효과 : aortic root을 oil red O 염색 후 죽상동맥경화증 병변 정량화 ▶ 죽상경화증 병변내 NLRP3 inflammasome 활성화 미치는 효과: 면역염색을 통해서 NLRP3와 ASC, 또는 caspase 1과 co-localzation 되는 병변 비교 ▶ 죽상경화증 병변에서 macrophage recruitment에 미치는 효과: MOMA-2 면역염색 ▶ Aorta segment homogenate에서 NLRP3, caspase-1, IL-18, IL-1β의 protein 발현 관찰 ▶ Oxidative stress 평가: 면역형광염색 aorta ROS 발현 관찰

세부목표 1 : 혈당 변동성이 NLRP3 임플라마좀 활성화와 pyroptosis에 미치는 영향 규명 ● THP-1 monocyte에서 혈당 변동성 모델 확립 THP-1 monocyte를 사용하여 normal glucose, high glucose, high-low glucose 3군으로 나누어서 실험을 수행 1) NLRP3, ASC, caspase-1, IL-18, IL-1β의 mRNA과 protein 발현과 caspase-1, IL-1β, IL-18의 activity 측정 2) Pyroptosis 평가: flow cytometric analysis 3) NLRP3 inhibitor (MCC950), caspase-1 inhibitor (YVAD) 또는 NLRP3 siRNA 통해서 혈당 변동성에 NLRP3 임플라마좀 활성이 연관되어 있는지 확인 세부목표 2 : 혈당 변동성이 NLRP3 임플라마좀 활성화를 유발시키는 작용기전 규명 ● THP-1 monocyte를 사용, 세부목표 1과 같은 모델로 실험 < ROS > 1) 혈당 변동성이 total ROS와 mitochondrial ROS 생성에 미치는 효과 확인 2) mitochondrial superoxide dismutase와 catalase activity 측정 3) N-acetyl-cysteine (ROS scavenger), TEMPO (specific mtROS scavenger) 전처리 후 NLRP3 임플라마좀 활성화에 미치는 효과 확인 < K+ efflux /Ca2+ influx > 1) 혈당 변동성이 K+ efflux를 촉진하는지 확인 2) K+ efflux 촉진제인 nigericine과 K+ efflux inhibitor인 KCl 전처리 후 혈당 변동성으로 인한 NLRP3 임플라마좀 활성화에 미치는 효과 조사 3) 혈당 변동성이 Ca2+ influx에 미치는 영향 조사 < Autophagy > 1) 혈당 변동성이 autophagy를 조절하는지 확인: LC3-Ⅱ, P62 protein 발현 조사 2) autophagosome formation에 중요한 beclin 1과 ATG5을 know-down 시킨 후 혈당변동성이 NLRP3 임플라마좀 활성에 미치는 영향 조사 세부목표 3 : Rat 모델에서 혈당 변동성이 NLRP3 임플라마좀 활성화와 혈관염증 발생에 미치는 영향 규명 ● Rat에서 혈당 변동성 모델 확립 1) Plasma: fasting glucose, IL-1β, IL-18, TNF-α, MCP-1를 측정 2) Peritoneal macrophages를 분리하여 NLRP3 임플라마좀 component mRNA와 protein 발현과 caspase-1과 IL-1β activity 측정, ROS, K+ efflux/Ca2+ influx, LC3-Ⅱ, P62 protein을 조사 3) Aorta 분리하여 NLRP3, ASC, caspase-1, IL-18, IL-1β의 mRNA과 protein 발현과 caspase-1, IL-1β activity 측정, 면역 염색방법으로 CD163, NLRP3, ASC, caspase-1 발현을 조사 4) Aortic endothelium 부착된 monocyte 숫자 조사