배경/목적: 본 연구는 유도성 nitric oxide synthase-적재 미네랄화 나노입자(inducible nitric oxide synthase-loaded mineralized nanoparticles, iNOS-MNPs)가 마우스 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)의 골분화(osteogenic differentiation)에 미치는 영향을 조사하였다. 방법: 우리는 iNOS 존재 하에서 음이온성 블록 공중합체 템플릿 매개 탄산칼슘(CaCO3) 미네랄화 공정을 이용하여 iNOS-MNPs를 제조하였다. iNOS-MNPs는 구형이며 크기 분포가 좁았다. iNOS는 변성 없이 MNP 내부에 안정적으로 적재되었다. ESCs의 세포질(cytosol)로 iNOS-MNPs가 성공적으로 도입되었는지를 확인하기 위해, 형광 분석으로 세포 내 일산화질소(nitric oxide, NO) 수준을 측정하였다. 또한 NO 효능 분자(effector molecule)인 사이클릭 구아노신 3',5'-모노포스페이트(cyclic guanosine 3',5' monophosphate, cGMP)도 경쟁 효소 면역분석법(competitive enzyme immunoassay)으로 정량하였다. iNOS-MNP 처리에 대한 세포 생존율은 cell counting kit-8(CCK-8) 분석을 사용하여 평가하였다. ESCs의 골분화를 조사하기 위해 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase, ALP) 활성 분석, 세포내 칼슘 정량 분석, 그리고 기질 미네랄화(matrix mineralization)를 위한 Alizarin red S 염색을 수행하였다. 또한 골분화 관련 인자인 Runt-related transcription factor 2(RUNX2), 오스테오칼신(osteocalcin, OCN), 오스테릭스(osterix, OSX)의 단백질 수준은 면역형광 염색 및 Western blot 분석을 통해 평가하였다. iNOS-MNP 유래 골분화와 관련된 복합 경로는 네트워크 기반 분석(network-based analysis)으로 평가하였다. 결과: iNOS-MNP를 포함한 세포는 대조군에 비해 NO와 cGMP 농도가 유의하게 증가하였다. 세포를 iNOS-MNP에 노출하였을 때 세포 생존율에 대한 부작용은 관찰되지 않았다. 특히 iNOS-MNP의 흡수는 ESCs의 골분화를 촉진하였다. 전사체(transcriptome) 프로파일링을 통해 1,836개의 차등 유도 유전자(differentially-induced genes)를 확보하였고, ClueGO 및 KEGG를 이용한 기능 농축 분석을 수행하였다. 이러한 분석을 통해 단백질 키나아제 활성(protein kinase activity), 에스트로겐 수용체 활성(estrogen receptor activity), 골형태형성단백질(bone morphogenetic protein, BMP) 수용체 결합(BMP receptor binding), 리간드 개폐 이온 채널(ligand-gated ion channel) 활성, 포스파티딜이노시톨 3-인산(phosphatidylinositol 3-phosphate) 결합 등 유의하게 농축되고 서로 연결된 분자 경로가 확인되었다. 결론: 본 연구 결과는 iNOS-MNP가 복합 신호 전달 경로를 통합하여 ESCs에서 골분화를 유도할 수 있음을 시사한다.

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