□ 1차 년도 □□ 치주인대줄기세포가 배양된 conditioned media (CM)의 secretome-soluble factor 분석 ● 2×105개의 치주인대줄기세포를 CM (serum‑free α-MEM)에 48시간 동안 배양함. ● 48시간 후 CM을 수집하여 1200 rpm, 5분 동안 원심분리를 진행하고 상층액을 취함. ● 다시 한번 상층액을 3000 rpm, 3분 동안 원심분리하여 새로운 CM 상층액을 수집함. ● Ultracel‑10 membrane (Millipore)을 이용하여 상층액을 ultrafiltering하여 농축시킴. ● Protein microarray를 실시하여 CM에 분비된 줄기세포 secretome-soluble factor를 프로파일링함 (세포가 없는 serum‑free α-MEM을 대조군으로 사용) □ 줄기세포 secretome의 extracellular vesicles (EVs) 분리 및 동정 ● 줄기세포 배양 48시간 후 상기의 방법으로 CM을 원심분리하여 상층액을 수집함. ● EVs isolation kit (Capturem™, TaKaRa)를 이용하여 제조사 제공 프로토콜에 따라 EVs 분리. ● 분리된 EVs는 단백질 정량을 실시하여 앞서 언급한 EVs의 exosome marker인 CD63, CD9, Alix의 발현을 Western blotting으로 검증함. ● 전자현미경 (TEM; transmission electron microscopy)을 이용하여 분리된 EVs morphology 분석 ● Dynamic light scattering를 통한 EVs의 크기 분포 분석 □ 2차 년도 □□ 줄기세포 EVs의 proteomics 분석 ● 상기의 방법으로 분리된 EVs를 soluble factor 분석과 마찬가지로 프로테오믹스 기법을 활용하여 단백체 (proteome) 발현 패턴 분석 및 biological function analysis를 실시함 ● 치주조직재생에 관여하는 pathways 및 이들의 network을 분석함. ● Soluble factor vs. EVs proteome 발현을 비교 분석하여 데이터 구축 □□ 치주질환 세포 모델을 이용한 줄기세포 secretome의 세포활성 조절 분석 ● 치주인대줄기세포에 Lipopolyssacharide (LPS)를 처리하여 치주질환세포 모델로 사용함. ● Soluble factor의 세포활성 회복 효능 평가: 상기의 방법으로 농축된 CM 상층액을 각각 2, 5, 10배로 희석한 배양액에 치주인대줄기세포를 배양하여 LPS에 의한 줄기세포의 저하된 세포활성의 회복 평가. ● EVs의 세포활성 회복 효능 평가: EVs를 농도별 (5, 10, 25 μg/ml)로 줄기세포에 처리하여 세포 활성 회복 분석. ● 세포활성 평가 실험에는 먼저 세포 증식에 대한 각 secretome의 역할을 CCK-8 assay 실시, 분석함. ● 또한 골분화 표지 효소인 alkaline phosphatase activity (ALP)와 세포 내 칼슘 농도 측정 및 세포외 기질의 mineralization 측정 (alizarin red s staining)등을 실시하여 각 secretome의 줄기세포 골분화에 대한 효능 검증함. ● Western blotting을 실시하여 치주조직 표지 단백질인 (PDL tissue markers)의 발현을 분석함. ● 다양한 분자세포생물학적 기법을 이용하여 각 secretome의 줄기세포 활성 회복에 관여하는 특이적 바이오마커 비교 분석 ● 전사체 차세대 서열 분석을 통한 각 secretome 특이적 골분화 관련 유전자 (mRNA 및 small RNA) 동정 및 비교 분석 ● Pathways 및 network-based analysis를 통해 soluble factor vs. EVs proteome 비교 분석 □ 3차 년도 □□ 줄기세포 secretome 기반 Cell-free scaffold의 생체활성도 분석 ● Periodontal defect 랫드 모델 제작 ● 8주령의 Sprague–Dawley rats의 left, right maxillary first molars를 발치하여 periodontal osseous defect 모델 제작 ● Collagen sponge를 각각의 CM과 EVs 용액에 12시간 이상 soaking (침지) 후 collagen sponge, collagen + CM, collagen + EVs 3종류의 scaffold를 제작하여 동물모델에 이식 ● Micro-CT Tomography Analysis 및 조직면역염색법을 이용하여 골 재생 효능 검증

본 연구는 홍합 접착단백질의 카테콜 작용기 도파민(dopamine)과 graphene 혼합물을 제작하고 기질에 매우 쉽고 경제적인 그래핀 코팅 방법으로 적용해 생체계면(biointerface)을 형성하는 연구임. 이를 통해 배아줄기세포의 골분화 제어 및 조절 기전 분석이 연구 목표임. 1~3차년도에서 폴리도파민-그래핀 바이오인터페이스의 줄기세포 생리활성·골분화 평가, 골분화 성장인자 방출형 나노입자 고정화 나노바이오인터페이스 제작 및 기능 평가 수행함. RNA sequencing 및 mRNA·small RNA 등 전사체(transcriptome) 분석으로 특이적 골분화 조절 메커니즘 규명 기대됨. 동종성 높은 분화 시스템 및 치료용 줄기세포 대량 생산 스크리닝 기반 확보 기대됨.

연구개발내용 1: NO 형성형 미네랄화 하이브리드 나노입자의 제조와 배아줄기세포 활성 평가 NO donor인 S-nitrosoglutathione (GSNO) 또는 세포내 L-arginine로부터 NO를 생성하는 iNOS 담지형 미네랄화 나노입자 (GSNO-MNP 또는 iNOS-MNP)제조 세포내 방출된 GSNO, iNOS의 NO 발생 기능 평가 NO에 의한 배아줄기세포의 활성 평가 연구개발내용 2: GSNO-MNP 또는 iNOS-MNP에 의한 배아줄기세포 골분화 평가 분자세포생물학적 기법을 이용한 배아줄기세포 골분화 양상 분석 각각의 나노입자에 의해 증가한 세포내 NO에 의한 줄기세포 골분화 메커니즘 분석 iNOS와 NO 특이적 줄기세포 골분화 유도 신호전달기전분석 연구개발내용 3: Calvarial Bone Defect 마우스 모델을 이용한 분화된 세포의 유효성 평가 분화된 세포를 수집하여 collagen membrane에 배양 면역형광염색법을 이용한 부착된 세포의 골세포 표지 단백질 발현 양상 분석 세포가 배양된 collagen membrane을 동물모델에 이식 및 골재생 효능 검증